エクスビボ ポリビニルアルコール培養におけるマウス造血幹細胞の増殖と遺伝子操作
Summary
ここでは、 ex vivo ポリビニルアルコールベースの増殖を使用してマウス造血幹細胞培養を開始、維持、および分析するためのプロトコルと、レンチウイルス形質導入およびエレクトロポレーションによってそれらを遺伝子操作する方法を紹介します。
Abstract
自己複製型多能性造血幹細胞(HSC)は、生涯を通じて造血をサポートし、移植後に血液系全体を再構成する能力があるため、重要な細胞型です。造血幹細胞は、さまざまな血液疾患の治癒的治療を表す幹細胞移植療法で臨床的に使用されています。造血幹細胞活性と造血を調節するメカニズムの理解と、新しいHSCベースの治療法の開発の両方に大きな関心が寄せられています。しかしながら、幹細胞幹細胞の ex vivoでの安定した培養および増殖は、取り扱い可能な ex vivo システムでこれらの幹細胞を研究する上で大きな障壁となってきた。我々は最近、移植可能なマウス造血幹細胞の長期的・大規模拡大を支援できるポリビニルアルコールベースの培養系と、それらを遺伝子編集する方法を開発しました。このプロトコルは、エレクトロポレーションおよびレンチウイルス形質導入 を介して マウスHSCを培養および遺伝子操作する方法について説明しています。このプロトコルは、HSC生物学と造血に関心のある幅広い実験血液学者に役立つことが期待されます。
Introduction
造血系は、酸素供給から病原体との戦いまで、特殊な血液および免疫細胞タイプを通じて、哺乳類のさまざまな重要なプロセスをサポートします。造血幹および前駆細胞(HSPC)1によって維持される血液系の恒常性をサポートするためには、継続的な血液産生(造血)が必要です1。最も原始的な造血細胞は造血幹細胞(HSC)であり、これは自己複製および多系統分化のためのユニークな能力を有する2,3。これはまれな細胞集団であり、主に成体の骨髄4に見られ、約30,000細胞に1個の頻度で発生します。造血幹細胞は、生涯にわたる造血をサポートし、血液学的ストレス後の造血を再確立するのに役立つと考えられています。これらの能力はまた、HSCが照射されたレシピエントへの移植後に造血系全体を安定して再構成することを可能にする5。これは、HSCの機能的定義を表しており、さまざまな血液および免疫疾患の治癒的治療法であるHSC移植療法の科学的根拠も形成します6。これらの理由から、造血幹細胞は実験血液学の主要な焦点です。
研究の大きな焦点にもかかわらず、HSCをex vivo7で安定的に増殖させることは依然として困難でした。私たちは最近、マウス造血幹細胞8用の最初の長期生体外増殖培養システムを開発しました。このアプローチは、移植可能なHSCを4週間の培養で234〜899倍拡大することができます。他のアプローチと比較して、プロトコルの主な変更は、血清アルブミンの除去と合成ポリマーへの置き換えでした。ポリビニルアルコール(PVA)は、マウスHSC培養8に最適なポリマーとして同定され、現在では他の造血細胞タイプ9の培養にも使用されています。しかし、Soluplus(ポリビニルカプロラクタム-アセテート – ポリエチレングリコールグラフトコポリマー)と呼ばれる別のポリマーも最近同定されており、クローンHSCの膨張を改善するようです10。ポリマーを使用する前は、ウシ胎児血清、ウシ血清アルブミン画分V、または組換え血清アルブミンの形態の血清アルブミンが使用されていましたが、これらはHSC増殖のサポートが限られており、短期間(~1週間)のex vivo培養のみをサポートしていました7。しかしながら、HSCを静止状態で保持するHSC培養プロトコルは、より長いエクスビボ培養時間をサポートできることに留意すべきである11、12。
他の培養方法と比較して、PVAベースの培養の主な利点は、生成できる細胞の数と、プロトコルを使用して幹細胞をex vivoで追跡できる時間の長さです。これは、マウスあたりの単離可能なHSCの数が少ない(数千人のみ)ことや、in vivoでHSCを経時的に追跡することの難しさなど、実験血液学の分野におけるいくつかの障壁を克服します。ただし、これらの培養物はHSC増殖を刺激しますが、in vivo HSCプールは主に定常状態で静止していることを覚えておくことが重要です13。さらに、培養物は造血幹細胞に選択的ですが、時間の経過とともに追加の細胞型が培養物とともに蓄積し、移植可能な造血幹細胞は1か月後に34細胞に約1個しか表しません。骨髄系造血前駆細胞は、これらのHSC培養において主要な夾雑細胞型であると思われる8。それにもかかわらず、これらの培養物を使用して、不均一な細胞集団からの造血幹細胞を濃縮することができます(例:c-Kit+骨髄HSPC14)。また、遺伝子操作のためのHSCの形質導入またはエレクトロポレーションもサポートしています14,15,16。不均一な培養HSPC集団からの造血幹細胞の同定を支援するために、CD201(EPCR)は最近、有用なex vivo HSCマーカー10,17,18として同定され、移植可能な造血幹細胞はCD201+CD150+c-Kit+Sca1+系統画分に限定されています。
このプロトコルでは、PVAベースのマウスHSC増殖培養を開始、維持、および評価する方法、およびエレクトロポレーションまたはレンチウイルスベクター形質導入を使用したこれらの培養内での遺伝子操作のプロトコルについて説明します。これらの手法は、様々な実験的血液学者にとって有用であることが期待されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルが、HSC生物学、造血、および血液学をより一般的に調査するための有用なアプローチを提供することを願っています。FACS精製HSCs8のPVAベースの培養法の最初の開発以来、この方法は拡張されてきた。例えば、この方法は、骨髄および負の表面荷電プレート14で富化されたc−Kitで機能することが示されている。形質導入およびエレクトロポレ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
フローサイトメトリーへのアクセスを提供してくれたWIMMフローサイトメトリーコアと、レンチウイルスベクターの生成にWIMMウイルススクリーニングコアに感謝します。この研究は、Kay Kendall Leukaemia FundとUK Medical Research Councilによって資金提供されました。
Materials
| Equipment | |||
| Dissection kit | Fisher Scientific | 12764416 | |
| Hemocytometer | Appleton Woods Ltd | HC002 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| Pestle and mortar | Scientific Laboratory Supplies Limited | X18000 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Materials | |||
| 5 mL syringe | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G needle | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| Kimtech wipes | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg | IDT | 1081058 | |
| Animal free recombinant mouse stem cell factor | Peprotech | AF-250-03 | |
| Animal free recombinant mouse thrombopoietin | Peprotech | AF-315-14 | |
| Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8) | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8) | Biolegend | 105828 | |
| Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34) | Biolegend | 135006 | |
| Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2) | Biolegend | 115914 | |
| Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | |
| Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1) | Biolegend | 103428 | |
| Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100704 | |
| Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100714 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7) | Biolegend | 108108 | |
| Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119) | Biolegend | 116204 | |
| CellBIND plates, 24-well | Corning | 3337 | negative surface charged |
| CellBIND plates, 96-well | Corning | 3330 | negative surface charged |
| Custom synthetic sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | Custom order | |
| Fetal bovine serum | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| Fibronectin Coated plates, 96-well | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x) | Gibco | 51500.056 | |
| Phosphate buffered saline | Alfa Aesar | J61196.AP | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| Propidium Iodide | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| Streptavidin APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Türks’ solution | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
References
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