Komplekse genetiske kretser er tidkrevende å designe, teste og optimalisere. For å lette denne prosessen transfekderes pattedyrceller på en måte som tillater testing av flere støkiometrier av kretskomponenter i en enkelt brønn. Denne protokollen skisserer trinnene for eksperimentell planlegging, transfeksjon og dataanalyse.
Pattedyrs genetiske kretser har vist potensialet til å fornemme og behandle et bredt spekter av sykdomstilstander, men optimalisering av nivåene av kretskomponenter er fortsatt utfordrende og arbeidskrevende. For å akselerere denne prosessen utviklet laboratoriet vårt polytransfeksjon, en utvidelse med høy gjennomstrømning av tradisjonell pattedyrtransfeksjon. I polytransfeksjon utfører hver celle i den transfekterte populasjonen i hovedsak et annet eksperiment, tester oppførselen til kretsen ved forskjellige DNA-kopinumre og tillater brukere å analysere et stort antall støkiometrier i en enkeltpottreaksjon. Så langt har polytransfeksjoner som optimaliserer forholdet mellom trekomponentkretser i en enkelt brønn av celler blitt demonstrert; I prinsippet kan samme metode brukes til utvikling av enda større kretser. Poly-transfeksjonsresultater kan enkelt brukes for å finne optimale forhold mellom DNA og ko-transfeksjon for forbigående kretser eller for å velge ekspresjonsnivåer for kretskomponenter for generering av stabile cellelinjer.
Her demonstrerer vi bruken av poly-transfeksjon for å optimalisere en trekomponentkrets. Protokollen begynner med eksperimentelle designprinsipper og forklarer hvordan poly-transfeksjon bygger på tradisjonelle co-transfeksjonsmetoder. Deretter utføres polytransfeksjon av celler og etterfulgt av flowcytometri noen dager senere. Til slutt analyseres dataene ved å undersøke skiver av enkeltcellestrømningscytometridataene som tilsvarer delmengder av celler med visse komponentforhold. I laboratoriet har polytransfeksjon blitt brukt til å optimalisere celleklassifiserere, tilbakemeldings- og feedforward-kontrollere, bistabile motiver og mange flere. Denne enkle, men kraftige metoden fremskynder designsykluser for komplekse genetiske kretser i pattedyrceller.
Feltet pattedyrs syntetiske biologi har raskt utviklet seg, fra å utvikle enkle sanse-og-respons-deler i dyrkede cellelinjer til optimalisering av komplekse nettverk av gener for å løse virkelige utfordringer innen diagnostikk og terapi1. Disse sofistikerte kretsene er i stand til å registrere biologiske innganger fra mikroRNA-profiler til cytokiner til småmolekylære legemidler, og implementere logiske prosesseringskretser, inkludert transistorer, båndpassfiltre, vippebrytere og oscillatorer. De har også vist lovende resultater i dyremodeller av sykdommer som kreft, leddgikt, diabetes og mange flere 1,2,3,4,5. Men etter hvert som kompleksiteten til en krets vokser, blir optimalisering av nivåene til hver av komponentene stadig mer utfordrende.
En spesielt nyttig type genetisk krets er en celleklassifiserer, som kan programmeres til å fornemme og reagere på cellulære tilstander. Selektiv produksjon av protein- eller RNA-utganger i spesifikke cellulære tilstander er et kraftig verktøy for å veilede og programmere differensiering av celler og organoider, identifisere og ødelegge syke celler og / eller uønskede celletyper, og regulere funksjonen til terapeutiske celler 1,2,3,4,5 . Imidlertid har det vært svært utfordrende å skape kretser i pattedyrceller som nøyaktig kan klassifisere celletilstander fra flere cellulære RNA- og / eller proteinarter.
En av de mest tidkrevende trinnene for å utvikle en celleklassifiseringskrets er å optimalisere de relative uttrykksnivåene av individuelle komponentgener, for eksempel sensorer og prosesseringsfaktorer, i kretsen. For å øke hastigheten på kretsoptimalisering og tillate konstruksjon av mer sofistikerte kretser, har nylig arbeid brukt matematisk modellering av celleklassifiseringskretser og deres komponenter for å forutsi optimale sammensetninger og topologier 6,7. Selv om dette har vist kraftige resultater så langt, er matematisk analyse begrenset av behovet for systematisk å karakterisere inngangsutgangsoppførselen til komponentgener i kretsen, noe som er tidkrevende. Videre kan et mylder av kontekstavhengige problemer dukke opp i komplekse genetiske kretser, noe som får oppførselen til en full krets til å trosse spådommer basert på individuelle delkarakteriseringer 8,9.
For raskere å utvikle og teste komplekse pattedyrkretser som celletilstandsklassifiserere, utviklet laboratoriet vår en teknikk som kalles polytransfeksjon10, en utvikling av plasmid-ko-transfeksjonsprotokoller. Ved ko-transfeksjon kompleksiseres flere plasmid-DNA-arter sammen med et positivt ladet lipid- eller polymerreagens, og leveres deretter til celler på en korrelert måte (figur 1A). Ved polytransfeksjon kompleksiseres plasmider separat med reagenset, slik at DNA fra hvert transfeksjonskompleks leveres til celler på en dekorrelert måte (figur 1B). Ved hjelp av denne metoden blir celler i den transfekterte populasjonen utsatt for mange kombinasjoner av forhold mellom to eller flere DNA-nyttelaster som bærer forskjellige kretskomponenter.
For å måle forholdet mellom kretskomponenter levert til hver celle, inneholder hvert transfeksjonskompleks i en poly-transfeksjon en konstitutivt uttrykt fluorescerende reporter som tjener som en proxy for cellulær opptak av komplekset. Filler DNA som ikke inneholder noen elementer som er aktive i en pattedyrcelle, brukes til å justere den relative mengden av fluorescerende reporter og kretskomponenter levert til en celle i et enkelt transfeksjonskompleks og diskuteres mer detaljert i diskusjonen. Et eksempel på filler-DNA brukt i Weiss-laboratoriet er et plasmid som inneholder en terminatorsekvens, men ingen promotor, kodingssekvens, etc. Celler med forskjellige forhold mellom kretskomponenter kan deretter sammenlignes for å finne optimale forhold for genkretsfunksjon. Dette gir igjen nyttige prediksjoner for å velge promotorer og andre kretselementer for å oppnå optimale genuttrykksnivåer når man kombinerer kretskomponenter i en enkelt vektor for genetisk integrasjon (f.eks. Et lentivirus, transposon eller landingspute). I stedet for å velge forhold mellom kretskomponenter basert på intuisjon eller via en tidkrevende prøve- og feilprosess, evaluerer polytransfeksjon et bredt spekter av støkiometrier mellom genetiske deler i en enkeltpottreaksjon.
I vårt laboratorium har poly-transfeksjon muliggjort optimalisering av mange genetiske kretser, inkludert celleklassifiserere, tilbakemeldings- og feedforward-kontrollere og bistabile motiver. Denne enkle, men kraftige metoden øker designsyklusene betydelig for komplekse genetiske kretser i pattedyrceller. Poly-transfeksjon har siden blitt brukt til å karakterisere flere genetiske kretser for å avsløre deres flerdimensjonale inngangsutgangsoverføringsfunksjoner ved høy oppløsning 10, optimalisere en alternativ kretstopologi for celletilstandsklassifisering11, og akselerere ulike publiserte12,13 og pågående prosjekter.
Her beskriver og skildrer vi arbeidsflyten for bruk av polytransfeksjon for raskt å optimalisere en genetisk krets (figur 2). Protokollen viser hvordan man genererer polytransfeksjonsdata av høy kvalitet og unngår flere vanlige feil i polytransfeksjonsprotokollen og dataanalysen (figur 3). Den demonstrerer deretter hvordan man bruker poly-transfeksjon for å karakterisere enkle kretskomponenter og i prosessen benchmark poly-transfeksjonsresultater mot ko-transfeksjon (figur 4). Endelig viser resultatene av polytransfeksjon optimalisering av kreftklassifiseringskretsen (figur 5).
Raske prototypingsmetoder som dataassistert design (CAD), breadboarding og 3D-utskrift har revolusjonert mekaniske, elektriske og siviltekniske disipliner. Evnen til raskt å søke gjennom mange mulige løsninger på en gitt utfordring akselererer i stor grad fremgang i et felt. Vi tror at poly-transfeksjon er en analog teknologi for biologisk engineering, som muliggjør rask prototyping av genetiske kretser. I tillegg krever andre raske prototypingsteknologier praktisk sekvensiell iterasjon av flere mulige løsninger, m…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke tidligere Weiss Lab-medlemmer som ledet eller bidro til å utvikle poly-transfeksjonsmetoden og dens anvendelse på celleklassifiserere: Jeremy Gam, Bre DiAndreth og Jin Huh; andre Weiss lab-medlemmer som har bidratt til videre metodeutvikling/optimalisering: Wenlong Xu, Lei Wang og Christian Cuba-Samaniego; Prof. Josh Leonard og gruppemedlemmer, inkludert Patrick Donahue og Hailey Edelstein, for å teste poly-transfeksjon og gi tilbakemelding; og professor Nika Shakiba for å invitere dette manuskriptet og gi tilbakemelding. Vi vil også takke National Institutes of Health [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792]; National Science Foundation [1745645]; Cancer Center Support (kjerne) Grant [P30CCA14051, delvis] fra NCI, og National Institutes of Health [P50GM098792] for finansiering av dette arbeidet.
15mL Corning Falcon conical tubes | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | |
24-well petri dish | Any company of choice | (Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free) | |
Bovine serum albumin | NEB | B9000S | |
Centrifuge | Any company of choice | Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf | |
Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX2000 | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | |
Cytoflow | Non-commercial software package | https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# | |
DMEM | VWR | 10-013-CV | Use the correct media for your cell type |
EDTA | ThermoFisher Scientific | 03690-100ML | |
Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F4135 | |
HEK cells | ATCC | CRL-1573 | Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently. |
HeLa cells | ATCC | CRL-12401 | Use the relevant cell type for your experiments. |
Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer | ThermoFisher Scientific | L3000001 | Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent |
LSRFortessa flow cytometer | BD Biosciences | N/A | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Any company of choice | ||
Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985070 | reduced serum medium |
Phosphate buffered saline | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
Rainbow calibration beads | Spherotech | URCP-100-2H | |
Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
Trypsin | VWR | 25-053-CI |