Неводная изоляция и обогащение железистых головчатых черешковых и сидячих трихом из Cannabis sativa
Summary
Представлен протокол для удобной и высокопроизводительной изоляции и обогащения железистых головчатых стеблевых и сидячих трихом из Cannabis sativa. Протокол основан на сухой, небуферной экстракции трихом с использованием только жидкого азота, сухого льда и нейлоновых сит и подходит для экстракции РНК и транскриптомного анализа.
Abstract
В этой статье представлен протокол для удобной и высокопроизводительной изоляции и обогащения железистых головчатых стеблевых и сидячих трихом из Cannabis sativa. Пути биосинтеза метаболизма каннабиноидов и летучих терпенов локализованы в основном в трихомах каннабиса , а изолированные трихомы полезны для анализа транскриптома. Существующие протоколы выделения железистых трихом для транскриптомной характеристики неудобны и обеспечивают скомпрометированные трихомные головки и относительно небольшое количество изолированных трихом. Кроме того, они полагаются на дорогостоящие аппараты и изолирующие среды, содержащие ингибиторы белка, чтобы избежать деградации РНК. Настоящий протокол предлагает объединить три отдельные модификации для получения большого количества изолированных железистых головчатых черешковых и сидячих трихом из зрелых женских соцветий и веерных листьев C. sativa соответственно. Первая модификация включает в себя замену жидкого азота на обычную изолирующую среду для облегчения прохождения трихом через микросита. Вторая модификация включает в себя использование сухого льда для отделения трихом от растительного источника. Третья модификация включает в себя последовательное прохождение растительного материала через пять микросит с уменьшающимися размерами пор. Микроскопическая визуализация продемонстрировала эффективность метода изоляции для обоих типов трихом. Кроме того, качество РНК, выделенной из изолированных трихом, соответствовало последующему транскриптомному анализу.
Introduction
Железистые трихомы представляют собой волосовидные структуры, присутствующие в растениях, которые содержат много вторичных метаболитов1 и представляют собой ценный банк новых биосинтетических генов и ферментов2. В каннабисе биосинтез важных вторичных метаболитов, каннабиноидов3 и терпенов4, локализуется в трихомах. Учитывая роль трихом в определении качества каннабиса как для медицинского, так и для рекреационного использования, представляет интерес изучение экспрессии генов трихом. Чтобы охарактеризовать экспрессию трихом-специфических генов, сначала необходимо выделить интересующие трихомы. Протоколы изоляции трихом были впервые описаны еще в 1992 году5, а их последние разработки были недавно пересмотрены2. В целом, протоколы экстракции железистых трихом для транскриптомной характеристики можно разделить на два отдельных последовательных этапа. Первый шаг включает в себя тщательное физическое отделение трихом от растительной ткани. Этот этап может быть выполнен с использованием сухого льда5, стеклянных шариков с помощью коммерческого устройства6,7, измельчения растительного материала против сетчатого сита8 или вихривания растительной ткани в изолирующем буфере9. Вторая стадия включает в себя более тонкое отделение интересующих трихом от микроскопических растительных остатков и/или других типов трихом. Этот этап может быть выполнен с помощью центрифугирования с градиентомплотности 8,10 или сит различных размеров 7,9. Из-за чрезвычайной чувствительности РНК в обработанных тканях к разлагающим агентам эти два последовательных этапа обычно проводят в ледяной изолирующей среде, часто в присутствии ингибиторов белка4.
Обычные протоколы изоляции трихом требуют, в дополнение к ледяным температурам, большого количества изолирующей среды для обеспечения эффективной процедуры экстракции. Сочетание этих компонентов приводит к трудному и длительному процессу изоляции, который препятствует высокой пропускной способности. Таким образом, представление простого, удобного для пользователя альтернативного протокола изоляции трихомы, вероятно, будет полезно для различных аспектов, связанных с характеристикой трихомы. Цель настоящей статьи состоит в том, чтобы предложить альтернативный протокол выделения черешковых и сидячих железистых головчатых трихом из Cannabis sativa путем объединения и интеграции нескольких элементов из обычных протоколов. Эти элементы включают сухой лед5, пропускание трихом через несколько микросит с уменьшением размера пор 7,9 и замену изолирующей среды8 жидким азотом (LN).
Новизна настоящего протокола изоляции трихом, по сравнению с традиционными протоколами, проявляется в ряде аспектов. Этот протокол удобен тем, что не требует опасных компонентов. Процедура может проводиться в лаборатории с минимальными мерами предосторожности и обеспечивает высокую пропускную способность. Замена LN на стандартную жидкую изолирующую среду обеспечивает целостность трихом на протяжении всего процесса изоляции, что позволяет проводить последующий транскриптомный анализ. После сублимации LN и сухого льда изолированные трихомы остаются свободными от вредных остатков. Кроме того, склонность LN к сублимации при комнатной температуре позволяет широко использовать его во всем протоколе. Напротив, использование больших объемов обычной изоляционной среды создает практические трудности при обращении с ней. Наконец, протокол уменьшает отделение клетки диска от оставшейся хрупкой структуры головки железистой трихомы, что позволяет сохранить содержимое свободного пространства.
Этот протокол представлен в подробном пошаговом виде, предназначенном для оказания технической помощи в выделении железистых головчатых трихом C. sativa. Протокол обеспечивает управляемый рабочий процесс, в результате которого получаются изолированные трихомы с высокой концентрацией и чистотой, подходящие для последующего молекулярного анализа.
Protocol
Representative Results
Discussion
По сравнению с имеющимися в настоящее время протоколами изоляции трихом, в настоящем протоколе описаны две основные модификации. К ним относятся отделение трихом от растительного материала с использованием сухого льда на начальном этапе и замена LN обычно используемой жидкой буферной…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность компании «КаннабиВар Лтд.» за финансовую поддержку. Весь растительный материал был щедро предоставлен профессором Хинанит Колтай из Центра Вулкани, Израиль.
Materials
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
- Schilmiller, A. L., Last, R. L., Pichersky, E. Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds. Plant Journal for Cell & Molecular Biology. 54 (4), 702-709 (2008).
- Liu, Y., Jing, S. X., Luo, S. H., Li, S. H. Non-volatile natural products in plant glandular trichomes: chemistry, biological activities and biosynthesis. Natural Product Reports. 36 (4), 626-665 (2019).
- Fairbairn, J. W. The trichomes and glands of Cannabis sativa L. UN Bulletin on Narcotics. 23, 29-33 (1972).
- Booth, J. K., Page, J. E., Bohlmann, J. Terpene synthases from Cannabis sativa. PLoS One. 12 (3), 0173911 (2017).
- Yerger, E. H., et al. A rapid method for isolating glandular trichomes. Plant Physiology. 99 (1), 1-7 (1992).
- Gershenzon, J., Maffei, M. M., Croteau, R. Biochemical and histochemical localization of monoterpene biosynthesis in the glandular trichomes of spearmint (Mentha spicata). Plant Physiology. 89 (4), 1351-1357 (1989).
- Gershenzon, J., et al. Isolation of secretory cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic studies of monoterpenes and other gland products. Analytical Biochemistry. 200 (1), 130-138 (1992).
- Conneely, L. J., Mauleon, R., Mieog, J., Barkla, B. J., Kretzschmar, T. Characterization of the Cannabis sativa glandular trichome proteome. PLoS One. 16 (4), 0242633 (2021).
- Liu, Y., Zhu, P., Cai, S., Haughn, G., Page, J. E. Three novel transcription factors involved in cannabinoid biosynthesis in Cannabis sativa L. Plant Molecular Biology. 106 (1-2), 49-65 (2021).
- Slone, J. H., Kelsey, R. G. Isolation and purification of glandular secretory cells from Artemisia tridentata (ssp. vaseyana) by Percoll density gradient centrifugation. American Journal of Botany. 72 (9), 1445-1451 (1985).
- Namdar, D., et al. Terpenoids and Phytocannabinoids Co-Produced in Cannabis Sativa Strains Show Specific Interaction for Cell Cytotoxic Activity. Molecules. 24 (17), 3031 (2019).
- McDowell, E. T., et al. Comparative functional genomic analysis of Solanum glandular trichome types. Plant Physiology. 155 (1), 524-539 (2011).
- Bergau, N., Santos, A. N., Henning, A., Balcke, G. U., Tissier, A. Autofluorescence as a signal to sort developing glandular trichomes by flow cytometry. Frontiers in Plant Science. 7, 949 (2016).
- Livingston, S. J., et al. Cannabis glandular trichomes alter morphology and metabolite content during flower maturation. The Plant Journal. 101 (1), 37-56 (2019).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Gland distribution and cannabinoid content in clones of Cannabis sativa L. American Journal of Botany. 64 (6), 687-693 (1977).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Quantitative determination of cannabinoids in individual glandular trichomes of Cannabis sativa L. (Cannabaceae). American Journal of Botany. 65 (10), 1103-1106 (1978).
- Hammond, C. T., Mahlberg, P. G. Morphology of glandular hairs of Cannabis sativa from scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 60 (6), 524-528 (1973).
- Marks, M. D., et al. A new method for isolating large quantities of Arabidopsis trichomes for transcriptome, cell wall, and other types of analyses. The Plant Journal. 56 (3), 483-492 (2008).
- Huebbers, J. W., et al. An advanced method for the release, enrichment and purification of high-quality Arabidopsis thaliana rosette leaf trichomes enables profound insights into the trichome proteome. Plant Methods. 18 (1), 12 (2022).
