Vi beskriver en protokol, der beskriver isoleringen af murinkolonkrypter til udvikling af 3-dimensionelle kolonoider. De etablerede kolonoider kan derefter differentieres terminalt for at afspejle den cellulære sammensætning af værtsepitelet, inden de modtager en inflammatorisk udfordring eller bliver instrueret til at etablere et epitelmonolag.
Tarmepitelet spiller en væsentlig rolle i menneskers sundhed og giver en barriere mellem værten og det ydre miljø. Dette meget dynamiske cellelag giver den første forsvarslinje mellem mikrobielle og immune populationer og hjælper med at modulere tarmens immunrespons. Forstyrrelse af epitelbarrieren er et kendetegn ved inflammatorisk tarmsygdom (IBD) og er af interesse for terapeutisk målretning. Det 3-dimensionelle kolonikultursystem er en yderst nyttig in vitro-model til undersøgelse af tarmstamcelledynamik og epitelcellefysiologi i IBD-patogenese. Ideelt set ville etablering af kolonier fra det betændte epitelvæv hos dyr være mest gavnligt ved vurderingen af de genetiske og molekylære påvirkninger på sygdom. Vi har imidlertid vist, at in vivo epitelændringer ikke nødvendigvis bevares i kolosider etableret fra mus med akut inflammation. For at imødegå denne begrænsning har vi udviklet en protokol til behandling af kolonier med en cocktail af inflammatoriske mediatorer, der typisk er forhøjet under IBD. Mens dette system kan anvendes allestedsnærværende på forskellige dyrkningsforhold, understreger denne protokol behandling af både differentierede kolonoider og 2-dimensionelle monolag afledt af etablerede kolonier. I en traditionel kulturindstilling er kolosider beriget med intestinale stamceller, hvilket giver et ideelt miljø til at studere stamcellenichen. Dette system tillader imidlertid ikke en analyse af funktionerne i tarmfysiologi, såsom barrierefunktion. Endvidere giver traditionelle kolonier ikke mulighed for at studere det cellulære respons af terminalt differentierede epitelceller til proinflammatoriske stimuli. De metoder, der præsenteres her, giver en alternativ eksperimentel ramme til at løse disse begrænsninger. Det 2-dimensionelle monolagskultursystem giver også mulighed for terapeutisk lægemiddelscreening ex vivo. Dette polariserede lag af celler kan behandles med inflammatoriske mediatorer på basalsiden af cellen og samtidig med formodede terapeutiske midler apisk for at bestemme deres anvendelighed i IBD-behandling.
Inflammatorisk tarmsygdom (IBD) er en kronisk, remitterende og recidiverende sygdom karakteriseret ved episoder af betændelse og klinisk hvile. IBD’s ætiologi er multifaktoriel, men nøglekarakteristika ved sygdommen inkluderer defekt barrierefunktion og øget permeabilitet af tarmepitelet ud over proinflammatoriske signalkaskader aktiveret i epitelrummet 1,2. Flere in vitro og in vivo modeller er blevet anvendt til at rekapitulere epitelresponset under IBD, herunder cellekultur og murine modeller af inflammation3. Imidlertid har alle disse systemer vigtige mangler, der begrænser deres evne til at rekapitulere epitelændringerne under IBD4. De fleste cellelinjer, der bruges til at studere IBD, transformeres, har evnen til at danne et monolag og kan differentiere3, men forplanter sig iboende anderledes end ikke-transformerede tarmepitelceller i værten. Flere forskellige murinmodeller af inflammation bruges til at studere IBD, hvoraf nogle inkluderer knockout-modeller, infektiøse modeller, kemiske inflammatoriske modeller og T-celleoverførselsmodeller 5,6,7,8. Mens hver enkelt kan studere visse etiologiske aspekter af IBD, såsom genetiske dispositioner, barrieredysfunktion, immunderegulering og mikrobiomet, er de begrænsede i deres evne til at studere sygdommens multifaktorielle karakter.
Intestinale organoider, herunder enteroider og colonoider, er blevet etableret i løbet af det sidste årti som en nyttig in vitro-model til undersøgelse af ikke kun dynamikken i intestinale stamceller, men også deres rolle: barriereintegriteten og funktionen af tarmepitelspillet spiller i intestinal homeostase og sygdom. Disse enheder har bidraget væsentligt til vores forståelse af patogenesen af IBD9 og har åbnet nye muligheder for personlig medicin. Colonoider, eller stamcelleafledte, selvorganiserende vævskulturer fra tyktarmen, er blevet udviklet fra både murin og humant væv i en proces, der gør det muligt for stamceller placeret i tarmkrypter at formere sig og opretholdes på ubestemt tid10. Stamcellenichen in vivo er afhængig af ekstracellulære faktorer for at understøtte dens vækst, især de kanoniske Wnt-signalveje og knoglemorfogene proteinsignalveje11. Tilføjelsen af disse faktorer fremmer kolonioidernes sundhed og levetid, men driver også kulturen mod en stamcellelignende tilstand, der ikke afspejler de vivo-epitelcellulær arkitektur, som består af både selvfornyende og terminalt differentierede celler12,13. Mens funktionaliteten af tarmepitelet er afhængig af den kontinuerlige krydstale mellem stamcellerummet og differentierede celler, er evnen til at have begge dele i et kolonoidkultursystem ret begrænset. På trods af disse begrænsninger forbliver organoidkultursystemet guldstandarden for at studere epithelets iboende egenskaber ex vivo. Ikke desto mindre kan det være nødvendigt at overveje alternative kulturstrategier for at besvare det videnskabelige spørgsmål, der er til rådighed.
Det har vist sig, at mus på et kontinuerligt 7-dages regime af dextrannatriumsulfat (DSS) udvikler både epitelbetændelse og barrieredysfunktion14. Desuden er mitokondriel biogenesesvigt og metabolisk omprogrammering i tarmepitelet, som har vist sig at være tydelige i human IBD, også blevet fanget i denne DSS-model af colitis15. Vores foreløbige data viser imidlertid, at egenskaberne ved mitokondriel biogenesefejl ikke bevares i kolonier afledt af krypterne hos DSS-behandlede dyr (supplerende figur 1). Således skal alternative dyrkningsmetoder anvendes, når man undersøger, hvordan inflammation driver epitelændringer under murin tarmbetændelse. Her skitserer vi en protokol, vi har udviklet, der beskriver 1) hvordan man isolerer krypter fra hele tyktarmsvæv til etablering af murinkolonoider, 2) hvordan man terminalt differentierer denne cellepopulation for at afspejle cellepopulationen, som den står in vivo, og 3) hvordan man inducerer betændelse i denne in vitro-model . For at studere lægemiddelinteraktioner inden for det betændte epitel har vi udviklet en protokol til etablering af 2-dimensonale (2D) monolag fra murine colonoider, der grundlæggende kan behandles med inflammatoriske mediatorer og apisk behandles med lægemiddelterapier.
Organoid udvikling har revolutioneret den måde, det videnskabelige samfund studerer organsystemer in vitro med evnen til delvist at rekapitulere cellulær struktur og funktion fra et dyr eller menneske i en skål. Desuden tilbyder organoidsystemer afledt af mennesker med sygdomme et lovende værktøj til personlig medicin, der kan styre terapeutisk beslutningstagning. Her beskriver vi en kryptisoleringsprotokol, der fungerer godt og introducerer vigtige trin, der gør det muligt at rydde op i overskydende snavs…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health Grants R01DK120986 (til K.P.M.).
0.4-μM transparent transwell, 24-well | Greiner Bio-one | 662-641 | |
15-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-269 | |
50-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-271 | |
70-μM cell strainer | VWR | 76327-100 | |
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
B-27 supplement | Invitrogen | 12587-010 | Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x) |
Chopsticks Electrode Set for EVO | World Precision Instruments | STX2 | |
Corning Matrigel GFR Membrane Mix | Corning | 354-230 | Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%) |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-5G | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water) |
DMEM high glucose | Thermo Fisher | 11960-069 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium | Gibco | 14190-144 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA) | Sigma-Aldrich | E7889 | Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM) |
Fetal Bovine Serum | Bio-Techne | S11150H | Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%) |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm | Thermo Fisher | 12-550-15 | |
G418 | InvivoGen | ant-ga-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
Gentamicin Reagent | Gibco/Fisher | 15750-060 | Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL) |
GlutaMAX-1 | Fisher Scientific | 35050-061 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM) |
hIFNγ | R&D Systems | 285-IF | Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
hIL-1β | R&D Systems | 201-LB | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
hTNFα | R&D Systems | 210-TA | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009 | Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media) |
Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
mEGF | Novus | NBP2-35176 | Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-5G | Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water) |
Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA) |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable | VWR | 25384-342 | |
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile | Greiner Bio-one | 5666-2160 | |
R-Spondin | R&D Systems | 3474-RS-050 | Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
Tryp LE Express | Thermo Fisher | 12604-013 | Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA) |
UltraPure Water | Invitrogen | 10977-023 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
Y-27632 dihyddrochloride | Abcam | ab120129 | Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water) |