وصفنا بروتوكولا يوضح بالتفصيل عزل خبايا القولون الفئران لتطوير القولون ثلاثي الأبعاد. يمكن بعد ذلك تمييز القولون الثابت بشكل نهائي ليعكس التركيب الخلوي لظهارة المضيف قبل تلقي تحد التهابي أو توجيهه لإنشاء طبقة أحادية ظهارية.
تلعب ظهارة الأمعاء دورا أساسيا في صحة الإنسان ، حيث توفر حاجزا بين المضيف والبيئة الخارجية. توفر طبقة الخلايا عالية الديناميكية هذه خط الدفاع الأول بين المجموعات الميكروبية والمناعية وتساعد على تعديل الاستجابة المناعية المعوية. اضطراب الحاجز الظهاري هو السمة المميزة لمرض التهاب الأمعاء (IBD) وهو ذو أهمية للاستهداف العلاجي. نظام زراعة القولون 3 الأبعاد هو نموذج مفيد للغاية في المختبر لدراسة ديناميات الخلايا الجذعية المعوية وفسيولوجيا الخلايا الظهارية في التسبب في مرض التهاب الأمعاء. من الناحية المثالية ، فإن إنشاء القولون من الأنسجة الظهارية الملتهبة للحيوانات سيكون أكثر فائدة في تقييم التأثيرات الجينية والجزيئية على المرض. ومع ذلك ، فقد أظهرنا أن التغيرات الظهارية في الجسم الحي لا يتم الاحتفاظ بها بالضرورة في القولون الذي تم إنشاؤه من الفئران المصابة بالتهاب حاد. لمعالجة هذا القيد ، قمنا بتطوير بروتوكول لعلاج القولون بمزيج من الوسطاء الالتهابيين الذين عادة ما يكونون مرتفعين أثناء مرض التهاب الأمعاء. في حين يمكن تطبيق هذا النظام في كل مكان على ظروف الثقافة المختلفة ، فإن هذا البروتوكول يؤكد على العلاج على كل من القولون المتمايز والطبقات أحادية الأبعاد 2 المشتقة من القولون الثابت. في بيئة الثقافة التقليدية ، يتم إثراء القولون بالخلايا الجذعية المعوية ، مما يوفر بيئة مثالية لدراسة مكانة الخلايا الجذعية. ومع ذلك ، لا يسمح هذا النظام بتحليل ميزات فسيولوجيا الأمعاء ، مثل وظيفة الحاجز. علاوة على ذلك ، لا توفر القولونات التقليدية الفرصة لدراسة الاستجابة الخلوية للخلايا الظهارية المتمايزة نهائيا للمنبهات الالتهابية. توفر الطرق المعروضة هنا إطارا تجريبيا بديلا لمعالجة هذه القيود. يوفر نظام الثقافة أحادية الطبقة 2 الأبعاد أيضا فرصة لفحص الأدوية العلاجية خارج الجسم الحي. يمكن علاج هذه الطبقة المستقطبة من الخلايا بوسطاء التهابيين على الجانب القاعدي من الخلية وبالتزامن مع العلاجات المفترضة قميا لتحديد فائدتها في علاج مرض التهاب الأمعاء.
مرض التهاب الأمعاء (IBD) هو مرض مزمن وتحويل وانتكاس يتميز بنوبات من الالتهاب والسكون السريري. مسببات مرض التهاب الأمعاء متعددة العوامل ، ولكن السمات المميزة الرئيسية للمرض تشمل وظيفة الحاجز المعيب وزيادة نفاذية ظهارة الأمعاء ، بالإضافة إلى شلالات الإشارات الالتهابية التي يتم تنشيطها داخل المقصورة الظهارية 1,2. تم استخدام العديد من النماذج في المختبر وفي الجسم الحي لتلخيص الاستجابة الظهارية أثناء مرض التهاب الأمعاء ، بما في ذلك زراعة الخلايا ونماذج الفئران للالتهاب3. ومع ذلك ، فإن كل هذه الأنظمة لديها أوجه قصور مهمة تحد من قدرتها على تلخيص التغيرات الظهارية خلال IBD4. يتم تحويل معظم خطوط الخلايا المستخدمة لدراسة مرض التهاب الأمعاء ، ولديها القدرة على تكوين طبقة أحادية ، ويمكن أن تفرق3 ولكنها تنتشر جوهريا بشكل مختلف عن الخلايا الظهارية المعوية غير المحولة في المضيف. يتم استخدام العديد من نماذج الفئران المختلفة للالتهاب لدراسة مرض التهاب الأمعاء ، وبعضها يشمل نماذج خروج المغلوب ، والنماذج المعدية ، والنماذج الالتهابية الكيميائية ، ونماذج نقل الخلايا التائية5،6،7،8. في حين أن كل منها يمكنه دراسة بعض الجوانب المسببة لمرض التهاب الأمعاء ، مثل الاستعدادات الوراثية ، واختلال الحاجز ، وإلغاء التنظيم المناعي ، والميكروبيوم ، إلا أنها محدودة في قدرتها على دراسة الطبيعة متعددة العوامل للمرض.
تم إنشاء الكائنات العضوية المعوية ، بما في ذلك الأمعاء والقولون ، على مدار العقد الماضي كنموذج مفيد في المختبر لدراسة ليس فقط ديناميات الخلايا الجذعية المعوية ولكن أيضا دورها في سلامة الحاجز ووظيفة ظهارة الأمعاء في التوازن المعوي والمرض. ساهمت هذه الكيانات بشكل كبير في فهمنا للتسبب في مرض التهاب الأمعاء9 وفتحت فرصا جديدة للطب الشخصي. تم تطوير القولون ، أو مزارع الأنسجة ذاتية التنظيم المشتقة من الخلايا الجذعية من القولون ، من كل من الفئران والأنسجة البشرية في عملية تسمح للخلايا الجذعية الموجودة داخل الخبايا المعوية بالتكاثر والحفاظ عليها إلى أجل غير مسمى10. يعتمد تخصص الخلايا الجذعية في الجسم الحي على عوامل خارج الخلية لدعم نموه ، ولا سيما إشارات Wnt المتعارف عليها ومسارات إشارات البروتين المورفوجيني للعظام11. إن إضافة هذه العوامل تعزز صحة وطول عمر القولون ولكنها تدفع أيضا الثقافة نحو حالة تشبه الخلايا الجذعية لا تعكس البنية الخلوية الظهارية في الجسم الحي ، والتي تتكون من خلايا ذاتية التجديد ومتمايزة نهائيا12,13. في حين أن وظيفة ظهارة الأمعاء تعتمد على الحديث المتبادل المستمر بين حجرة الخلايا الجذعية والخلايا المتمايزة ، فإن القدرة على الحصول على كليهما في نظام زراعة القولون محدودة إلى حد ما. على الرغم من هذه القيود ، يظل نظام الاستزراع العضوي هو المعيار الذهبي لدراسة الخصائص الجوهرية للظهارة خارج الجسم الحي. ومع ذلك ، قد يلزم النظر في استراتيجيات الثقافة البديلة للإجابة على السؤال العلمي المطروح.
لقد ثبت أن الفئران التي تتبع نظاما مستمرا لمدة 7 أيام من كبريتات الصوديوم ديكستران (DSS) تصاب بالتهاب ظهاري وخلل في الحاجز14. علاوة على ذلك ، تم أيضا التقاط فشل التكوين الحيوي للميتوكوندريا وإعادة البرمجة الأيضية داخل ظهارة الأمعاء ، والتي ثبت أنها واضحة في مرض التهاب الأمعاء البشري ، في نموذج DSS هذا لالتهاب القولون15. ومع ذلك ، توضح بياناتنا الأولية أن خصائص فشل التكوين الحيوي للميتوكوندريا لا يتم الاحتفاظ بها في القولون المشتق من خبايا الحيوانات المعالجة ب DSS (الشكل التكميلي 1). وبالتالي ، يجب استخدام طرق الثقافة البديلة عند فحص كيفية دفع الالتهاب للتغيرات الظهارية أثناء التهاب الأمعاء الفئران. هنا ، نحدد بروتوكولا قمنا بتطويره يصف 1) كيفية عزل الخبايا من أنسجة القولون الكاملة لإنشاء قولون الفئران ، 2) كيفية التمييز النهائي بين هذه الخلايا لتعكس عدد الخلايا كما هو الحال في الجسم الحي ، و 3) كيفية إحداث التهاب في هذا النموذج في المختبر . لدراسة التفاعلات الدوائية داخل الظهارة الملتهبة ، قمنا بتطوير بروتوكول لإنشاء طبقات أحادية 2-dimensonal (2D) من قولون الفئران التي يمكن علاجها بشكل أساسي باستخدام وسطاء التهابيين ومعالجتها قميا بالعلاجات الدوائية.
أحدث تطور المواد العضوية ثورة في الطريقة التي يدرس بها المجتمع العلمي أنظمة الأعضاء في المختبر مع القدرة على تلخيص البنية الخلوية والوظيفة جزئيا من أو إنسان في طبق. علاوة على ذلك ، توفر الأنظمة العضوية المشتقة من البشر المصابين بأمراض أداة واعدة للطب الشخصي الذي يمكن أن يوجه عملية صن…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للمنح الصحية R01DK120986 (إلى K.P.M.).
0.4-μM transparent transwell, 24-well | Greiner Bio-one | 662-641 | |
15-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-269 | |
50-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-271 | |
70-μM cell strainer | VWR | 76327-100 | |
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
B-27 supplement | Invitrogen | 12587-010 | Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x) |
Chopsticks Electrode Set for EVO | World Precision Instruments | STX2 | |
Corning Matrigel GFR Membrane Mix | Corning | 354-230 | Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%) |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-5G | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water) |
DMEM high glucose | Thermo Fisher | 11960-069 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium | Gibco | 14190-144 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA) | Sigma-Aldrich | E7889 | Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM) |
Fetal Bovine Serum | Bio-Techne | S11150H | Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%) |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm | Thermo Fisher | 12-550-15 | |
G418 | InvivoGen | ant-ga-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
Gentamicin Reagent | Gibco/Fisher | 15750-060 | Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL) |
GlutaMAX-1 | Fisher Scientific | 35050-061 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM) |
hIFNγ | R&D Systems | 285-IF | Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
hIL-1β | R&D Systems | 201-LB | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
hTNFα | R&D Systems | 210-TA | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009 | Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media) |
Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
mEGF | Novus | NBP2-35176 | Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-5G | Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water) |
Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA) |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable | VWR | 25384-342 | |
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile | Greiner Bio-one | 5666-2160 | |
R-Spondin | R&D Systems | 3474-RS-050 | Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
Tryp LE Express | Thermo Fisher | 12604-013 | Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA) |
UltraPure Water | Invitrogen | 10977-023 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
Y-27632 dihyddrochloride | Abcam | ab120129 | Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water) |