Studera epiteleffekterna av tarminflammation in vitro på etablerade murina kolonioider
Summary
Vi beskriver ett protokoll som beskriver isoleringen av murina kolonkrypter för utveckling av 3-dimensionella kolonoider. De etablerade kolonoiderna kan sedan differentieras terminalt för att återspegla värdepitelets cellulära sammansättning innan de får en inflammatorisk utmaning eller riktas för att etablera ett epitelialt monolager.
Abstract
Tarmepitelet spelar en viktig roll för människors hälsa, vilket ger en barriär mellan värden och den yttre miljön. Detta mycket dynamiska cellskikt ger den första försvarslinjen mellan mikrobiella och immunpopulationer och hjälper till att modulera tarmens immunsvar. Störning av epitelbarriären är ett kännetecken för inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) och är av intresse för terapeutisk inriktning. Det 3-dimensionella kolonoidodlingssystemet är en extremt användbar in vitro-modell för att studera tarmstamcellsdynamik och epitelcellsfysiologi vid IBD-patogenes. Helst skulle etablering av kolonoider från inflammerad epitelvävnad hos djur vara mest fördelaktigt vid bedömning av genetiska och molekylära influenser på sjukdom. Vi har emellertid visat att epitelförändringar in vivo inte nödvändigtvis behålls i kolonoider etablerade från möss med akut inflammation. För att ta itu med denna begränsning har vi utvecklat ett protokoll för att behandla kolonoider med en cocktail av inflammatoriska mediatorer som vanligtvis är förhöjda under IBD. Även om detta system kan tillämpas allestädes närvarande på olika odlingsförhållanden, betonar detta protokoll behandling på både differentierade kolonoider och 2-dimensionella monolager härledda från etablerade kolonoider. I en traditionell odlingsmiljö berikas kolonoider med tarmstamceller, vilket ger en idealisk miljö för att studera stamcellsnischen. Detta system tillåter emellertid inte en analys av funktionerna i tarmfysiologin, såsom barriärfunktion. Vidare erbjuder traditionella kolonoider inte möjlighet att studera det cellulära svaret hos terminalt differentierade epitelceller till proinflammatoriska stimuli. De metoder som presenteras här ger en alternativ experimentell ram för att hantera dessa begränsningar. Det 2-dimensionella monolagerkultursystemet erbjuder också en möjlighet till terapeutisk läkemedelsscreening ex vivo. Detta polariserade skikt av celler kan behandlas med inflammatoriska mediatorer på cellens basala sida och samtidigt med förmodade terapeutiska medel apikalt för att bestämma deras användbarhet vid IBD-behandling.
Introduction
Inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) är en kronisk, remitterande och återfallande sjukdom som kännetecknas av episoder av inflammation och klinisk lugn. Etiologin för IBD är multifaktoriell, men viktiga karakteristiska egenskaper hos sjukdomen inkluderar defekt barriärfunktion och ökad permeabilitet i tarmepitelet, förutom proinflammatoriska signalkaskader aktiverade i epitelfacket 1,2. Flera in vitro- och in vivo-modeller har använts för att rekapitulera epitelsvaret under IBD, inklusive cellodling och murina modeller av inflammation3. Alla dessa system har dock viktiga brister som begränsar deras förmåga att rekapitulera epitelförändringarna under IBD4. De flesta cellinjer som används för att studera IBD transformeras, har förmågan att bilda ett monolager och kan differentiera3 men i sig sprida sig annorlunda än icke-transformerade tarmepitelceller i värden. Flera olika murina modeller av inflammation används för att studera IBD, varav några inkluderar knockoutmodeller, infektiösa modeller, kemiska inflammatoriska modeller och T-cellöverföringsmodeller 5,6,7,8. Medan var och en kan studera vissa etiologiska aspekter av IBD, såsom genetiska predispositioner, barriärdysfunktion, immunavreglering och mikrobiomet, är de begränsade i sin förmåga att studera sjukdomens multifaktoriella natur.
Intestinala organoider, inklusive enteroider och kolonoider, har etablerats under det senaste decenniet som en användbar in vitro-modell för att studera inte bara dynamiken hos tarmstamceller utan också deras roll, barriärens integritet och funktion av tarmepitelet spelar i tarmhomeostas och sjukdom. Dessa enheter har väsentligt bidragit till vår förståelse av patogenesen av IBD9 och har öppnat nya möjligheter för personlig medicin. Colonoids, eller stamcellshärledda, självorganiserande vävnadskulturer från tjocktarmen, har utvecklats från både murin och mänsklig vävnad i en process som tillåter stamceller som finns i tarmkrypter att sprida sig och bibehållas på obestämd tid10. Stamcellsnischen in vivo förlitar sig på extracellulära faktorer för att stödja dess tillväxt, särskilt den kanoniska Wnt-signaleringen och benmorfogena proteinsignalvägar11. Tillägget av dessa faktorer främjar hälsan och livslängden hos colonoids men driver också kulturen mot ett stamcellsliknande tillstånd som inte återspeglar de vivo-epitelcellulär arkitektur, som består av både självförnyande och terminalt differentierade celler12,13. Medan funktionaliteten hos tarmepitelet är beroende av den kontinuerliga överhörningen mellan stamcellsfacket och differentierade celler, är förmågan att ha båda i ett kolonoidodlingssystem ganska begränsad. Trots dessa begränsningar förblir organoidodlingssystemet guldstandarden för att studera epitelets inneboende egenskaper ex vivo. Ändå kan alternativa kulturstrategier behöva övervägas för att svara på den vetenskapliga frågan.
Det har visats att möss på en kontinuerlig 7-dagars regim av dextrannatriumsulfat (DSS) utvecklar både epitelinflammation och barriärdysfunktion14. Vidare har mitokondriell biogenessvikt och metabolisk omprogrammering inom tarmepitelet, som har visat sig vara uppenbara vid human IBD, också fångats i denna DSS-modell av kolit15. Våra preliminära data visar dock att egenskaperna hos mitokondriell biogenesfel inte bibehålls i kolonoider härledda från krypterna hos DSS-behandlade djur (kompletterande figur 1). Således måste alternativa odlingsmetoder användas när man undersöker hur inflammation driver epitelförändringar under murin tarminflammation. Här beskriver vi ett protokoll som vi har utvecklat som beskriver 1) hur man isolerar krypter från hel kolonvävnad för etablering av murina colonoider, 2) hur man terminalt differentierar denna cellpopulation för att återspegla cellpopulationen som den står in vivo, och 3) hur man inducerar inflammation i denna in vitro-modell . För att studera läkemedelsinteraktioner inom det inflammerade epitelet har vi utvecklat ett protokoll för att etablera 2-dimensonala (2D) monolager från murina kolonoider som i grunden kan behandlas med inflammatoriska mediatorer och behandlas apikalt med läkemedelsterapier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Organoidutveckling har revolutionerat hur det vetenskapliga samfundet studerar organsystem in vitro med förmågan att delvis rekapitulera cellulär struktur och funktion från ett djur eller människa i en maträtt. Vidare erbjuder organoidsystem som härrör från människor med sjukdomar ett lovande verktyg för personlig medicin som kan vägleda terapeutiskt beslutsfattande. Här beskriver vi ett kryptisoleringsprotokoll som fungerar bra och introducerar viktiga steg som gör det möjligt att städa upp öve…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grants R01DK120986 (till K.P.M.).
Materials
| 0.4-μM transparent transwell, 24-well | Greiner Bio-one | 662-641 | |
| 15-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-269 | |
| 50-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-271 | |
| 70-μM cell strainer | VWR | 76327-100 | |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| B-27 supplement | Invitrogen | 12587-010 | Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x) |
| Chopsticks Electrode Set for EVO | World Precision Instruments | STX2 | |
| Corning Matrigel GFR Membrane Mix | Corning | 354-230 | Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%) |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-5G | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water) |
| DMEM high glucose | Thermo Fisher | 11960-069 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium | Gibco | 14190-144 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA) | Sigma-Aldrich | E7889 | Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM) |
| Fetal Bovine Serum | Bio-Techne | S11150H | Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%) |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm | Thermo Fisher | 12-550-15 | |
| G418 | InvivoGen | ant-ga-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
| Gentamicin Reagent | Gibco/Fisher | 15750-060 | Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL) |
| GlutaMAX-1 | Fisher Scientific | 35050-061 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM) |
| hIFNγ | R&D Systems | 285-IF | Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| hIL-1β | R&D Systems | 201-LB | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| hTNFα | R&D Systems | 210-TA | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009 | Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media) |
| Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| mEGF | Novus | NBP2-35176 | Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-5G | Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water) |
| Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable | VWR | 25384-342 | |
| Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile | Greiner Bio-one | 5666-2160 | |
| R-Spondin | R&D Systems | 3474-RS-050 | Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
| Tryp LE Express | Thermo Fisher | 12604-013 | Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA) |
| UltraPure Water | Invitrogen | 10977-023 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Y-27632 dihyddrochloride | Abcam | ab120129 | Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water) |
References
- Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences: The epithelial barrier and its relationship with mucosal immunity in inflammatory bowel disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
- McGuckin, M. A., Rajaraman, E., Simms, L. A., Florin, T. H. J., Radford-Smith, G. Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (1), 100-113 (2009).
- Joshi, A., Soni, A., Acharya, S. In vitro models and ex vivo systems used in inflammatory bowel disease. In Vitro Models. 1 (3), 213-227 (2022).
- Goyal, N., Rana, A., Ahlawat, A., Bijjem, K. R., Kumar, P. Animal models of inflammatory bowel disease: A review. Inflammopharmacology. 22 (4), 219-233 (2014).
- Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: Concepts, considerations, and tricks of the trade. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 296 (2), 135-146 (2009).
- Bhinder, G., et al. The Citrobacter rodentium mouse model: Studying pathogen and host contributions to infectious colitis. Journal of Visualized Experiments. (72), e50222 (2013).
- Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunological Reviews. 169, 195-207 (1999).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Dotti, I., Salas, A. Potential use of human stem cell-derived intestinal organoids to study inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (12), 2501-2509 (2018).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Santos, A. J. M., Lo, Y. H., Mah, A. T., Kuo, C. J. The intestinal stem cell niche: Homeostasis and adaptations. Trends in Cell Biology. 28 (12), 1062-1078 (2018).
- Yin, X., et al. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
- Wilson, S. S., et al. Optimized culture conditions for improved growth and functional differentiation of mouse and human colon organoids. Frontiers in Immunology. 11, 547102 (2021).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), e3678 (2012).
- Cunningham, K. E., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1-α (PGC1α) protects against experimental murine colitis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10184-10200 (2016).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2481 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Julian, M. W., et al. Intestinal epithelium is more susceptible to cytopathic injury and altered permeability than the lung epithelium in the context of acute sepsis. International Journal of Experimental Pathology. 92 (5), 366-376 (2011).
- Haberman, Y., et al. Ulcerative colitis mucosal transcriptomes reveal mitochondriopathy and personalized mechanisms underlying disease severity and treatment response. Nature Communications. 10, 38 (2019).
- Yang, S., et al. Mitochondrial transcription factor A plays opposite roles in the initiation and progression of colitis-associated cancer. Cancer Communications. 41 (8), 695-714 (2021).
- Maidji, E., Somsouk, M., Rivera, J. M., Hunt, P. W., Stoddart, C. A. Replication of CMV in the gut of HIV-infected individuals and epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathogen. 13, 1006202 (2017).
- Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 452-470 (2017).
- Grondin, J., Kwon, Y., Far, P., Haq, S., Khan, W. Mucins in Intestinal mucosal defense and inflammation: Learning from clinical and experimental studies. Frontiers in Immunology. 11, 2054 (2020).
- Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration. Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).
- Yui, S., et al. YAP/TAZ-Dependent reprogramming of colonic epithelium links ECM remodeling to tissue regeneration. Cell Stem Cell. 22 (1), 35-49 (2018).
- Komiya, Y., Habas, R. Wnt signal transduction pathways. Organogenesis. 4 (2), 68-75 (2008).
