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Médecine

전체 세포 패치 클램프 기술을 통한 H9C2 심근 세포에 전압 의존적 칼륨 전류 기록

Published: November 11, 2022
doi:
10.3791/64805
, , , , , , ,
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Chengdu Techman Instrument Co., Ltd., 3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5School of Ethnic Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

본 프로토콜은 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 H9c2 심근 세포에서 전압 게이트 칼륨 (Kv) 채널 전류의 실시간 및 동적 획득을위한 효율적인 방법을 설명합니다.

Abstract

심근 세포막의 칼륨 채널은 세포 전기 생리 학적 활동의 조절에 중요한 역할을합니다. 주요 이온 채널 중 하나인 전압 게이트 칼륨(Kv) 채널은 약물로 인한 심근 손상 및 심근 경색과 같은 일부 심각한 심장 질환과 밀접한 관련이 있습니다. 본 연구에서, H9c2 심근 세포에서 Kv 채널 전류 (IKv)에 대한 1.5 mM 4- 아미노 피리딘 (4-AP, 광범위 칼륨 채널 억제제) 및 아코 니틴 (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM)의 효과를 결정하기 위해 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하였다. 4-AP는 I Kv를 약 54% 억제한 반면, IKv에 대한 AC의 억제 효과는 용량 의존적 경향을 나타냄을 알 수 있었다(25μM에 대해서는 효과 없음, 50μM에 대해서는 30% 억제율, 100μM에 대해서는 46% 억제율 및 200μM에 대해서는 54% 억제율). 더 높은 감도와 정밀도의 특성으로 인해이 기술은 심장 독성 및 이온 채널을 표적으로 삼는 민족 의학의 약리학 적 효과에 대한 탐구를 촉진 할 것입니다.

Introduction

이온 채널은 세포막의 지질 이중층에 내장 된 특수 통합 단백질입니다. 활성화제의 존재 하에서, 이러한 특수 통합 단백질의 중심은 고도로 선택적인 친수성 기공을 형성하여, 적절한 크기 및 전하의 이온이 수동수송 방식으로 통과하도록 한다1. 이온 채널은 세포 흥분성과 생체 전기의 기초이며 다양한세포 활동에서 중요한 역할을 합니다2. 심장은 활동 전위3에 의해 시작된 흥분-수축 결합 과정으로 인한 규칙적인 수축을 통해 다른 기관에 혈액을 공급합니다. 이전 연구에 따르면 심근 세포의 활동 전위 생성은 세포 내 이온 농도의 변화로 인해 발생하며 인간 심근 세포에서 Na +,Ca 2+ 및 K + 이온 채널의 활성화 및 비활성화는 특정 시퀀스 4,5,6에서 활동 전위의 형성으로 이어집니다. 교란된 전압 게이트 칼륨(Kv) 채널 전류(IKv)는 정상적인 심장 리듬을 변화시켜 주요 사망 원인 중 하나인 부정맥을 유발할 수 있습니다. 따라서 IKv를 기록하는 것은 생명을 위협하는 부정맥7을 치료하기위한 약물의 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다.

Kv 채널은 칼륨 채널의 중요한 구성 요소입니다. Kv 채널의 배위 기능은 포유류 심장의 전기적 활동 및 심근 수축성에 중요한 역할을합니다 8,9,10. 심근 세포에서 활동 전위의 진폭과 지속 시간은 여러 Kv 채널 하위 유형11에 의한 외부 K + 전류의 공동 전도에 따라 달라집니다. Kv 채널 기능의 조절은 심장 활동 전위의 정상적인 재분극에 매우 중요합니다. Kv 전도도의 가장 작은 변화조차도 심장 재분극에 큰 영향을 미치고 부정맥12,13의 가능성을 증가시킵니다.

세포 전기생리학적 연구의 기본 방법을 나타내는 세포막의 작은 영역과 전체 세포 패치 클램프 기록을 위한 피펫 팁 사이의 고저항 밀봉은 음압을 적용하여 설정할 수 있습니다. 지속적인 음압은 세포막이 피펫 팁과 접촉하여 피펫의 내벽에 달라붙게 합니다. 결과적인 완전한 전기 회로는 세포막(14)의 표면을 가로지르는 임의의 단일 이온 채널 전류를 기록할 수 있게 한다. 이 기술은 세포막 이온 채널 전류에 대해 매우 높은 감도를 가지며 모든 이온 채널에서 전류를 감지하는 데 사용할 수 있으며 응용 분야는 매우 광범위합니다15. 또한, 형광 표지 및 방사성 표지와 비교하여, 패치 클램프는 더 높은 권위 및 정확도를 갖는다16. 현재 전체 셀 패치 클램프 기술은 Kv 채널 전류17,18,19에 작용하는 한의학 성분을 감지하는 데 사용되었습니다. 예를 들어, Wang 등은 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 연꽃 종자의 유효 성분이 활성화 된 상태 채널19를 차단함으로써 Kv4.3 채널의 억제를 달성 할 수 있음을 확인했습니다. Aconitine (AC)은 Aconitum carmichaeli Debx 및 Aconitum pendulum Busch와 같은 Aconitum 종의 효과적이고 활성 성분 중 하나입니다. 수많은 연구에 따르면 AC의 과다 복용은 부정맥과 심지어 심장 마비를 유발할 수 있습니다20. AC와 전압 게이트 이온 채널 사이의 상호 작용은 심장 독성21의 핵심 메커니즘 인 세포 내 이온 항상성의 파괴로 이어진다. 따라서이 연구에서는 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 심근 세포의 IKv에 대한 AC의 효과를 결정합니다.

Protocol

상업적으로 입수한 H9c2 래트 심근세포( 재료 표 참조)를 5%CO2 가습 분위기에서 37°C에서 10% 열불활성화된 태아 소 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 중에서 인큐베이션하였다. 그런 다음 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 정상 H9c2 세포 및 4-AP- 또는 AC 처리 세포에서 IKb 의 변화를 감지했습니다 (그림 1 및 <strong class="xfig…

Representative Results

이 프로토콜은 전체 세포 패치 클램프 기술에서 설정된 파라미터에 따라 IKv의 기록을 허용했습니다. IKv는 -60 mV의 유지 전위에서 -40에서 +60 mV까지 150ms의 탈분극 펄스 자극에 의해 트리거되었습니다(그림 3A). H9c2 쥐 심근 세포의 IKv는 처음에는 -20 mV 부근에서 나타 났으며, 그 후 진폭은 추가 탈분극으로 증가했다. IKv와 막 전위 사이의 평균 관?…

Discussion

패치-클램프 전기생리학적 기술은 주로 세포막(25) 상의 이온 채널의 전기적 활성 및 기능적 특성을 기록하고 반영하는데 사용된다. 현재, 패치 클램프 기술의 주요 기록 방법은 단일 채널 기록 및 전체 셀 기록(26)을 포함한다. 전체 셀 모드의 경우, 유리 미세전극 및 음압은 세포막의 작은 영역과 피펫 팁(27) 사이에 고저항 밀봉을 형성하는데 ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

중국 국립 자연 과학 재단 (82130113)과 칭하이 성 과학 기술부 (2020-SF-C33)의 핵심 R & D 및 혁신 프로그램의 재정 지원에 감사드립니다.

Materials

4-Aminopyridine Sigma MKCJ2184
Aconitine Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd DSTDW000602
Amplifier Axon Instrument MultiClamp 700B
Analytical Balance Sartorius 124S-CW
ATP Na2 Solarbio 416O022
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length)  Sutter Instrument 163225-5
Cell culture dish (100 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cell culture dish (35 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 3012022
Clampex software Molecular Devices, LLC. Version 10. 5
Clampfit software Molecular Devices, LLC. Version 10. 6. 0. 13 data acqusition software
D-(+)-glucose Rhawn RH289133
Digital camera Hamamatsu C11440
Digitizer Axon Instrument Axon digidata 1550B
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco 8121587
EGTA Biofroxx EZ6789D115
Fetal bovine serum Gibco 2166090RP
Flaming/brown micropipette puller Sutter Instrument Model P-1000
H9c2 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0111
HCImageLive Hamamatsu 4.5.0.0
HCl Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd 2106081
HEPES Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd 20210221
KCl Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020082501
KOH Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020112601
MgCl2 Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute 20160408
MgCl2·6H2O Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2021020101
Micromanipulator Sutter Instrument MP-285A
Microscope Olympus IX73
Microscope cover glass (20 × 20 mm) Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd 80340-0630
Milli-Q Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd Milli-Q IQ 7005
MultiClamp 700B commander Axon Instrument MultiClamp commander 2.0 signal-amplifier software 
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
PH meter  Mettler Toledo S201K
Phosphate buffered saline (1x) Gibco 8120485
Trypsin 0.25% (1x) HyClone J210045
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Keywords: Voltage-dependent Potassium CurrentWhole-cell Patch-clamp TechniqueH9C2 CardiomyocytesIon Channel ResearchPharmacological MechanismsCardiotoxicityMicropipette PullerBorosilicate Glass CapillaryDigital Analog ConverterSignal AmplifierMicro ManipulatorData Acquisition SoftwareLeak SubtractionMembrane Test
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Jiang, H., Zhang, Y., Hou, Y., Li, L., Zhang, S., Zhang, Y., Meng, X., Wang, X. Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique. J. Vis. Exp. (189), e64805, doi:10.3791/64805 (2022).
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