Denne protokollen beskriver en effektiv metode for sanntids og dynamisk oppkjøp av spenningsstyrte kalium (Kv) kanalstrømmer i H9c2 kardiomyocytter ved bruk av helcellepatch-klemmeteknikken.
Kaliumkanaler på myokardcellemembranen spiller en viktig rolle i reguleringen av celleelektrofysiologiske aktiviteter. Å være en av de viktigste ionkanalene, er spenningsstyrte kaliumkanaler (Kv) nært forbundet med noen alvorlige hjertesykdommer, for eksempel legemiddelindusert myokardskade og hjerteinfarkt. I denne studien ble helcellepatchklemmeteknikken brukt for å bestemme effekten av 1,5 mM 4-aminopyridin (4-AP, en bredspektret kaliumkanalhemmer) og akonitin (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM og 200 μM) på Kv-kanalstrømmen (IKv) i H9c2 kardiomyocytter. Det ble funnet at 4-AP hemmet I Kv med ca. 54%, mens den hemmende effekten av AC på IKv viste en doseavhengig trend (ingen effekt for 25 μM, 30% hemmende rate for 50 μM, 46% hemmende rate for 100 μM og 54% hemmende rate for 200 μM). På grunn av egenskapene til høyere følsomhet og presisjon, vil denne teknikken fremme utforskningen av kardiotoksisitet og de farmakologiske effektene av etnomedisinmålrettede ionkanaler.
Ionkanaler er spesielle integrerte proteiner innebygd i lipid dobbeltlaget av cellemembranen. I nærvær av aktivatorer danner sentrene til slike spesielle integrerte proteiner svært selektive hydrofile porer, slik at ioner av passende størrelse og ladning kan passere gjennom på en passiv transportmåte1. Ionekanaler er grunnlaget for celle excitability og bioelektrisitet og spiller en nøkkelrolle i en rekke cellulære aktiviteter2. Hjertet leverer blod til andre organer gjennom regelmessige sammentrekninger som følge av en eksitasjonskontraksjonskoblet prosess initiert av handlingspotensialer3. Tidligere studier har bekreftet at genereringen av aksjonspotensialer i kardiomyocytter er forårsaket av endringen i intracellulær ionkonsentrasjon, og aktivering og inaktivering av Na+, Ca2+ og K+ ionkanaler i humane kardiomyocytter fører til dannelse av aksjonspotensialer i en bestemt sekvens 4,5,6. Forstyrret spenningsstyrt kalium (Kv) kanalstrømmer (IKv) kan endre normal hjerterytme, noe som fører til arytmier, som er en av de viktigste dødsårsakene. Derfor er registrering av IKv avgjørende for å forstå mekanismene til legemidler for behandling av livstruende arytmier7.
Kv-kanalen er en viktig komponent i kaliumkanalen. Koordinasjonsfunksjonen til Kv-kanalen spiller en viktig rolle i den elektriske aktiviteten og myokardial kontraktiliteten til pattedyrhjertet 8,9,10. I kardiomyocytter avhenger amplituden og varigheten av aksjonspotensialer av samledning av utgående K+-strømmer av flere Kv-kanalundertyper11. Reguleringen av Kv-kanalfunksjonen er svært viktig for normal repolarisering av hjertets aksjonspotensial. Selv den minste endringen i Kv-konduktans påvirker i stor grad hjerterepolarisering og øker muligheten for arytmi12,13.
Representerer en grunnleggende metode i cellulær elektrofysiologisk forskning, kan en høybestandig tetning mellom et lite område av cellemembranen og en pipettespiss for helcelle patch-klemmeopptak etableres ved å påføre et negativt trykk. Det kontinuerlige negative trykket gjør at cellemembranen kommer i kontakt med pipettespissen og fester seg på pipettens indre vegg. Den resulterende komplette elektriske kretsen gjør det mulig å registrere en hvilken som helst enkelt ionkanalstrøm over overflaten av cellemembranen14. Denne teknikken har en meget høy følsomhet for cellemembranionekanalstrømmen og kan brukes til å oppdage strømmer i alle ionkanaler, og applikasjonene er ekstremt brede15. Videre, sammenlignet med fluorescerende merking og radioaktiv merking, har patch-klemme høyere autoritet og nøyaktighet16. For tiden har helcellepatch-klemmeteknikken blitt brukt til å oppdage de tradisjonelle kinesiske medisinkomponentene som virker på Kv-kanalstrømmer17,18,19. For eksempel brukte Wang og medarbeidere helcellepatch-klemmeteknikken og bekreftet at den effektive komponenten av lotusfrøet kunne oppnå hemming av Kv4.3-kanalen ved å blokkere de aktiverte tilstandskanalene19. Akonitin (AC) er en av de effektive og aktive ingrediensene i Aconitum arter, som Aconitum carmichaeli Debx og Aconitum pendel Busch. Tallrike studier har vist at overdoser av AC kan forårsake arytmier og til og med hjertestans20. Samspillet mellom vekselstrøm og spenningsstyrte ionkanaler fører til forstyrrelse av intracellulær ionhomeostase, som er nøkkelmekanismen for kardiotoksisitet21. Derfor, i denne studien, brukes helcellepatch-klemmeteknikken til å bestemme effekten av AC på IKv av kardiomyocytter.
Den patch-clamp elektrofysiologiske teknikken brukes hovedsakelig til å registrere og reflektere den elektriske aktiviteten og funksjonelle egenskapene til ionkanaler på cellemembranen25. For tiden inkluderer de viktigste opptaksmetodene for patch-klemmeteknikken enkeltkanalsopptak og helcelleopptak26. For helcellemodus brukes glassmikroelektroden og undertrykket til å danne en høymotstandsforsegling mellom et lite område av cellemembranen og en pipettespiss<sup class=…
The authors have nothing to disclose.
Vi setter pris på den økonomiske støtten fra National Natural Science Foundation of China (82130113) og Key R&D and Transformation Program fra Science & Technology Department of Qinghai Province (2020-SF-C33).
4-Aminopyridine | Sigma | MKCJ2184 | |
Aconitine | Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd | DSTDW000602 | |
Amplifier | Axon Instrument | MultiClamp 700B | |
Analytical Balance | Sartorius | 124S-CW | |
ATP Na2 | Solarbio | 416O022 | |
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length) | Sutter Instrument | 163225-5 | |
Cell culture dish (100 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
Cell culture dish (35 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 3012022 | |
Clampex software | Molecular Devices, LLC. | Version 10. 5 | |
Clampfit software | Molecular Devices, LLC. | Version 10. 6. 0. 13 | data acqusition software |
D-(+)-glucose | Rhawn | RH289133 | |
Digital camera | Hamamatsu | C11440 | |
Digitizer | Axon Instrument | Axon digidata 1550B | |
DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco | 8121587 | |
EGTA | Biofroxx | EZ6789D115 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 2166090RP | |
Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 | |
H9c2 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0111 | |
HCImageLive | Hamamatsu | 4.5.0.0 | |
HCl | Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd | 2106081 | |
HEPES | Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd | 20210221 | |
KCl | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020082501 | |
KOH | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020112601 | |
MgCl2 | Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute | 20160408 | |
MgCl2·6H2O | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2021020101 | |
Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285A | |
Microscope | Olympus | IX73 | |
Microscope cover glass (20 × 20 mm) | Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd | 80340-0630 | |
Milli-Q | Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd | Milli-Q IQ 7005 | |
MultiClamp 700B commander | Axon Instrument | MultiClamp commander 2.0 | signal-amplifier software |
OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
PH meter | Mettler Toledo | S201K | |
Phosphate buffered saline (1x) | Gibco | 8120485 | |
Trypsin 0.25% (1x) | HyClone | J210045 |