Her beskriver vi en protokol, der skitserer, hvordan man isolerer humane ovariefollikler fra frosset-optøet kortikalt væv for at udføre genekspressionsanalyser.
Æggestokken er et heterogent organ sammensat af forskellige celletyper. For at studere de molekylære mekanismer, der forekommer under follikulogenese, kan lokaliseringen af proteiner og genekspression udføres på fast væv. For korrekt at vurdere genekspressionsniveauer i en menneskelig follikel skal denne komplekse og sarte struktur isoleres. Derfor er en tilpasset protokol, der tidligere er beskrevet af Woodruffs laboratorium, blevet udviklet til at adskille follikler (oocyt- og granulosacellerne) fra deres omgivende miljø. Det kortikale væv i æggestokkene behandles først manuelt for at opnå små fragmenter ved hjælp af to værktøjer: en vævsskærer og en vævshelikopter. Vævet fordøjes derefter enzymatisk med 0,2% kollagenase og 0,02% DNase i mindst 40 min. Dette fordøjelsestrin udføres ved 37 °C og 5 % CO2 og ledsages af mekanisk pipettering af substratet hvert 10. minut. Efter inkubation opsamles de isolerede follikler manuelt ved hjælp af en kalibreret mikrokapillærpipette under mikroskopforstørrelse. Hvis follikler stadig er til stede i vævsstykkerne, afsluttes proceduren med manuel mikrodissektion. Folliklerne opsamles på is i et dyrkningsmedium og skylles to gange i dråber fosfatbufret saltopløsning. Denne fordøjelsesprocedure skal kontrolleres omhyggeligt for at undgå follikelforringelse. Så snart folliklernes struktur synes at være kompromitteret eller efter højst 90 minutter, stoppes reaktionen med en 4 °C-blokerende opløsning indeholdende 10 % føtalt bovint serum. Der skal indsamles mindst 20 isolerede follikler (størrelse under 75 μm) for at opnå en tilstrækkelig mængde total RNA efter RNA-ekstraktion til kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid (RT-qPCR). Efter ekstraktion når kvantificeringen af total RNA fra 20 follikler en middelværdi på 5 ng/μL. Det samlede RNA retrotranskriberes derefter til cDNA, og generne af interesse analyseres yderligere ved hjælp af RT-qPCR.
Æggestokken er et komplekst organ sammensat af funktionelle og strukturelle enheder, herunder folliklerne i cortex og stroma. Follikulogenese, processen med follikelaktivering, vækst og modning fra en primordial hvilende tilstand til en moden follikel, der kan befrugtes og understøtte tidlig embryonal udvikling, undersøges bredt i forskning1. At optrævle de mekanismer, der driver dette fænomen, kan forbedre fertilitetsplejen for kvinder2. Analyser af fast humant væv gør det muligt at vurdere proteinekspression og genlokalisering inden for ovariens funktionelle enheder 3,4. Imidlertid er specifikke teknikker nødvendige for at adskille folliklerne fra den omgivende cortex for nøjagtigt at vurdere genekspressionsniveauer inden for æggestokkene. Derfor blev der i en tidligere undersøgelse udviklet en follikelisoleringsteknik for at muliggøre analyser af genekspression direkte fra den funktionelle enhed i æggestokken5. Forskellige tilgange er blevet udviklet, såsom enzymatisk fordøjelse og / eller mekanisk isolering samt laserfangstmikrodissektion, der tillader follikelisolering i et stykke væv 6,7,8,9. Follikelisolering anvendes i vid udstrækning, enten med humant eller animalsk ovarievæv, til at evaluere folliklernes genekspressionsprofiler på alle udviklingsstadier10,11,12. En optimal isolationsprocedure bør dog tage højde for follikelens skrøbelige struktur i den tætte cortex og bør derfor udføres med omhu for at undgå skader7. Dette manuskript beskriver en procedure, tilpasset fra en protokol beskrevet af Woodruffs laboratorium, til at isolere humane follikler fra frosne-optøede ovariebark for at udføre genekspressionsanalyser13.
Det første trin i ovariefollikelisolering fra frosset humant væv er optøningsproceduren. Denne proces udføres på grundlag af den kliniske protokol, der anvendes til podning af kryopræserveret ovarievæv, som tidligere beskrevet14,15. Processen sigter mod at fjerne de kryoprotektive midler ved at skylle æggestokkens cortex i faldende koncentrationer af mediet. Derefter fragmenteres vævet før enzymatisk og mekanisk isolering for at hente folliklerne. Follikler på forskellige stadier kan skelnes ved hjælp af et stereomikroskop med høj forstørrelse og optik af god kvalitet for at isolere dem af interesse. Hver isoleret follikel måles ved hjælp af en lineal integreret i mikroskopet, og folliklerne kan samles i henhold til deres udviklingsstadium: primordiale follikler (30 μm), primære follikler (60 μm), sekundære follikler (120-200 μm) og antrale follikler (>200 μm)16. Yderligere klassificering kan udføres i henhold til folliklernes morfologi: primordiale follikler har et lag fladede granulosaceller (GC’er), primære follikler har et lag kuboide GC’er, sekundære follikler har mindst to lag kuboide GC’er, og tilstedeværelsen af et hulrum blandt GC’erne karakteriserer antralstadiet. Når follikler af interesse vælges, udføres RNA-ekstraktion. RNA-mængden og -kvaliteten evalueres forud for kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid (RT-qPCR) (figur 1).
Kryopræservering af ovarievæv er en lovende tilgang til bevarelse af kræftpatienters fertilitet. I klinikken podes optøet kortikalt væv tilbage i patienten efter remission, hvilket muliggør genoptagelse af ovariefunktion og fertilitet19,20. Udover klinisk brug kan resterende ovariefragmenter også doneres til forskning i slutningen af opbevaringsperioden for at studere de mekanismer, der regulerer follikulogenese. Desuden er dette væv særligt nyttigt til …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af et Excellence of Science (EOS) tilskud (ID: 30443682). I.D. er associeret forsker ved Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).
2 mm gridded Petri dish | Corning | 430196 | |
2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
2100 Expert software | Agilent | version B.02.08.SI648 | |
4-wells plate | Sigma Aldrich | D6789 | |
6-wells plate | Carl Roth | EKX5.1 | |
Agilent total RNA 6000 pico kit | Agilent | 5067-1513 | |
Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes | Sigma Aldrich | A5177 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
Collagenase IV | LifeTechnologies | 17104-019 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
DNase | Sigma Aldrich | D4527-10kU | |
FBS | Gibco | 10270-106 | |
GoScript reverse transcriptase | Promega | A5003 | |
HSA | CAF DCF | LC4403-41-080 | |
Leibovitz-15 | LifeTechnologies | 11415-049 | |
L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes | LifeTechnologies | 12330-031 | |
McIlwain tissue chopper | Stoelting | 51350 | |
Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm | CooperSurgical | 7-72-2200/1 | |
Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm | CooperSurgical | 7-72-2075/1 | |
NanoDrop 2000/2000c operating software | ThermoFisher | version 1.6 | |
NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | 2000/2000c | |
Penicillin G | Sigma Aldrich | P3032 | |
PowerTrack SYBR green master mix | ThermoFisher | A46109 | |
Primers: GDF9 | F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG | ||
Primers: HPRT | F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA | ||
Primers: Kit Ligand | F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT | ||
Real-Time qPCR Quantstudio 3 | ThermoFisher | A33779 | |
RNAqueous-micro total RNA isolation kit | ThermoFisher | AM1931 | |
Selenium | Sigma Aldrich | S9133 | |
Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
Streptomycine sulfate | Sigma Aldrich | S1277 | |
Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
Thermo Scientific Forma Series II water-jacketed CO2 incubators | ThermoFisher | 3110 | |
Thomas Stadie-Riggs tissue slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | |
Transferrin | Roche | 10652202001 |