यहां, हम जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण करने के लिए जमे हुए-पिघले हुए कॉर्टिकल ऊतक से मानव डिम्बग्रंथि के रोम को अलग करने के तरीके को रेखांकित करने वाले प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
अंडाशय एक विषम अंग है जो विभिन्न कोशिका प्रकारों से बना है। कूपिकोजेनेसिस के दौरान होने वाले आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए, प्रोटीन और जीन अभिव्यक्ति का स्थानीयकरण निश्चित ऊतक पर किया जा सकता है। हालांकि, मानव कूप में जीन अभिव्यक्ति के स्तर का ठीक से आकलन करने के लिए, इस जटिल और नाजुक संरचना को अलग किया जाना चाहिए। इसलिए, वुड्रफ की प्रयोगशाला द्वारा पहले वर्णित एक अनुकूलित प्रोटोकॉल को उनके आसपास के वातावरण से रोम (अंडाणु और ग्रैनुलोसा कोशिकाओं) को अलग करने के लिए विकसित किया गया है। डिम्बग्रंथि कॉर्टिकल ऊतक को पहले दो उपकरणों का उपयोग करके छोटे टुकड़े प्राप्त करने के लिए मैन्युअल रूप से संसाधित किया जाता है: एक ऊतक स्लाइसर और एक ऊतक चॉपर। ऊतक को तब कम से कम 40 मिनट के लिए 0.2% कोलेजनेस और 0.02% डीनेस के साथ एंजाइमेटिक रूप से पचाया जाता है। यह पाचन चरण 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर किया जाता है और हर 10 मिनट में माध्यम की यांत्रिक पाइपिंग के साथ होता है। इनक्यूबेशन बाद, पृथक रोम को माइक्रोस्कोप आवर्धन के तहत कैलिब्रेटेड माइक्रोकेशिका पिपेट का उपयोग करके मैन्युअल रूप से एकत्र किया जाता है। यदि रोम अभी भी ऊतक के टुकड़ों में मौजूद हैं, तो प्रक्रिया मैन्युअल माइक्रोडिसेक्शन के साथ पूरी होती है। रोम को एक कल्चर माध्यम में बर्फ पर एकत्र किया जाता है और फॉस्फेट-बफर्ड खारा घोल की बूंदों में दो बार धोया जाता है। कूप बिगड़ने से बचने के लिए इस पाचन प्रक्रिया को सावधानीपूर्वक नियंत्रित किया जाना चाहिए। जैसे ही रोम की संरचना से समझौता किया जाता है या अधिकतम 90 मिनट के बाद, प्रतिक्रिया को 4 डिग्री सेल्सियस ब्लॉकिंग समाधान के साथ रोक दिया जाता है जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम होता है। वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर) के लिए आरएनए निष्कर्षण के बाद कुल आरएनए की पर्याप्त मात्रा प्राप्त करने के लिए न्यूनतम 20 पृथक रोम (75 μm से कम आकार) एकत्र किए जाने चाहिए। निष्कर्षण के बाद, 20 रोम से कुल आरएनए का परिमाणीकरण 5 एनजी / μL के औसत मूल्य तक पहुंच जाता है। कुल आरएनए को तब सीडीएनए में रेट्रोट्रांसक्रिप्ट किया जाता है, और आरटी-क्यूपीसीआर का उपयोग करके रुचि के जीन का विश्लेषण किया जाता है।
अंडाशय एक जटिल अंग है जो कार्यात्मक और संरचनात्मक इकाइयों से बना है, जिसमें कॉर्टेक्स और स्ट्रोमा के भीतर रोम शामिल हैं। फॉलिकुलोजेनेसिस, एक आदिम अवस्था से एक परिपक्व कूप तक कूप सक्रियण, विकास और परिपक्वता की प्रक्रिया जो निषेचित होने और प्रारंभिक भ्रूण के विकास का समर्थन करने में सक्षम है, अनुसंधान1 में व्यापक रूप से अध्ययन किया गया है। इस घटना को चलाने वाले तंत्र को उजागर करने से महिलाओं के लिए प्रजनन देखभाल में सुधार हो सकताहै। निश्चित मानव ऊतक पर विश्लेषण अंडाशय 3,4 की कार्यात्मक इकाइयों के भीतर प्रोटीन अभिव्यक्ति और जीन स्थानीयकरण के मूल्यांकन की अनुमति देता है। हालांकि, डिम्बग्रंथि के रोम के भीतर जीन अभिव्यक्ति के स्तर का सही आकलन करने के लिए आसपास के कॉर्टेक्स से रोम को अलग करने के लिए विशिष्ट तकनीकों की आवश्यकता होती है। इसलिए, पिछले अध्ययन में, अंडाशय5 की कार्यात्मक इकाई से सीधे जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण की अनुमति देने के लिए एक कूप अलगाव तकनीक विकसित की गई थी। विभिन्न दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं, जैसे कि एंजाइमेटिक पाचन और / या यांत्रिक अलगाव, साथ ही लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन, जो ऊतक 6,7,8,9 के टुकड़े के भीतर कूप अलगाव की अनुमति देता है। विकास के सभी चरणों में रोम के जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल का मूल्यांकन करने के लिए, मानव या पशु डिम्बग्रंथि ऊतक के साथ कूप अलगाव का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। हालांकि, एक इष्टतम अलगाव प्रक्रिया को घने कॉर्टेक्स के भीतर कूप की नाजुक संरचना को ध्यान में रखना चाहिए और इसलिए, किसीभी क्षति से बचने के लिए देखभाल के साथ किया जाना चाहिए। यह पांडुलिपि एक प्रक्रिया का वर्णन करती है, जिसे वुड्रफ की प्रयोगशाला द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल से अनुकूलित किया गया है, ताकि जीनअभिव्यक्ति विश्लेषण करने के लिए जमे हुए-पिघले हुए डिम्बग्रंथि प्रांतस्था से मानव रोम को अलग किया जा सके।
जमे हुए मानव ऊतक से डिम्बग्रंथि कूप अलगाव का पहला चरण पिघलने की प्रक्रिया है। यह प्रक्रिया क्रायोसंरक्षित डिम्बग्रंथि ऊतक के ग्राफ्टिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले नैदानिक प्रोटोकॉल के आधार पर की जाती है, जैसा कि पहले वर्णित14,15 था। इस प्रक्रिया का उद्देश्य माध्यम की घटती सांद्रता में डिम्बग्रंथि प्रांतस्था को धोकर क्रायोप्रोटेक्टेंट एजेंटों को हटाना है। फिर, रोम को पुनः प्राप्त करने के लिए एंजाइमेटिक और यांत्रिक अलगाव से पहले ऊतक खंडित हो जाता है। विभिन्न चरणों में रोम को उच्च आवर्धन और अच्छी गुणवत्ता वाले प्रकाशिकी के साथ स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके अलग किया जा सकता है ताकि रुचि के लोगों को अलग किया जा सके। प्रत्येक पृथक कूप को माइक्रोस्कोप में एकीकृत एक शासक का उपयोग करके मापा जाता है, और रोम को उनके विकास चरण के अनुसार पूल किया जा सकता है: आदिम रोम (30 μm), प्राथमिक रोम (60 μm), द्वितीयक रोम (120-200 μm), और एंट्रल फॉलिकल्स (>200 μm)16। रोम की आकृति विज्ञान के अनुसार आगे का वर्गीकरण किया जा सकता है: आदिम रोम में चपटा ग्रैनुलोसा कोशिकाओं (जीसी) की एक परत होती है, प्राथमिक रोम में घनाकार जीसी की एक परत होती है, द्वितीयक रोम में घनाभ जीसी की कम से कम दो परतें होती हैं, और जीसी के बीच एक गुहा की उपस्थिति एंट्रल चरण की विशेषता है। जब रुचि के रोम का चयन किया जाता है, तो आरएनए निष्कर्षण किया जाता है। आरएनए मात्रा और गुणवत्ता का मूल्यांकन वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर) (चित्रा 1) से पहले किया जाता है।
डिम्बग्रंथि के ऊतकों का क्रायोप्रिजर्वेशन कैंसर रोगियों की प्रजनन क्षमता को संरक्षित करने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है। क्लिनिक में, पिघले हुए कॉर्टिकल ऊतक को छूट के बाद रोगी में वापस ग्राफ्ट किया ?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को विज्ञान की उत्कृष्टता (ईओएस) अनुदान (आईडी: 30443682) द्वारा समर्थित किया गया था। आईडी फोंड्स नेशनल डे ला रेचरचे साइंटिफिक डी बेल्जिक (एफएनआरएस) में एक सहयोगी शोधकर्ता हैं।
2 mm gridded Petri dish | Corning | 430196 | |
2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
2100 Expert software | Agilent | version B.02.08.SI648 | |
4-wells plate | Sigma Aldrich | D6789 | |
6-wells plate | Carl Roth | EKX5.1 | |
Agilent total RNA 6000 pico kit | Agilent | 5067-1513 | |
Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes | Sigma Aldrich | A5177 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
Collagenase IV | LifeTechnologies | 17104-019 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
DNase | Sigma Aldrich | D4527-10kU | |
FBS | Gibco | 10270-106 | |
GoScript reverse transcriptase | Promega | A5003 | |
HSA | CAF DCF | LC4403-41-080 | |
Leibovitz-15 | LifeTechnologies | 11415-049 | |
L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes | LifeTechnologies | 12330-031 | |
McIlwain tissue chopper | Stoelting | 51350 | |
Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm | CooperSurgical | 7-72-2200/1 | |
Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm | CooperSurgical | 7-72-2075/1 | |
NanoDrop 2000/2000c operating software | ThermoFisher | version 1.6 | |
NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | 2000/2000c | |
Penicillin G | Sigma Aldrich | P3032 | |
PowerTrack SYBR green master mix | ThermoFisher | A46109 | |
Primers: GDF9 | F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG | ||
Primers: HPRT | F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA | ||
Primers: Kit Ligand | F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT | ||
Real-Time qPCR Quantstudio 3 | ThermoFisher | A33779 | |
RNAqueous-micro total RNA isolation kit | ThermoFisher | AM1931 | |
Selenium | Sigma Aldrich | S9133 | |
Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
Streptomycine sulfate | Sigma Aldrich | S1277 | |
Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
Thermo Scientific Forma Series II water-jacketed CO2 incubators | ThermoFisher | 3110 | |
Thomas Stadie-Riggs tissue slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | |
Transferrin | Roche | 10652202001 |