Genuttrycksanalyser i humana folliklar
Summary
Här beskriver vi ett protokoll som beskriver hur man isolerar humana äggstocksfolliklar från fryst tinad kortikal vävnad för att utföra genuttrycksanalyser.
Abstract
Äggstocken är ett heterogent organ som består av olika celltyper. För att studera de molekylära mekanismer som uppstår under follikulogenesen kan lokalisering av proteiner och genuttryck utföras på fast vävnad. Men för att korrekt bedöma genuttrycksnivåer i en mänsklig follikel måste denna komplexa och känsliga struktur isoleras. Därför har ett anpassat protokoll som tidigare beskrivits av Woodruffs laboratorium utvecklats för att separera folliklar (oocyten och granulosacellerna) från deras omgivande miljö. Den ovariella kortikala vävnaden bearbetas först manuellt för att erhålla små fragment med hjälp av två verktyg: en vävnadsskivare och en vävnadshackare. Vävnaden spjälkas sedan enzymatiskt med 0,2% kollagenas och 0,02% DNas i minst 40 min. Detta uppslutningssteg utförs vid 37 °C och 5 %CO2 och åtföljs av mekanisk pipettering av mediet var 10:e minut. Efter inkubation uppsamlas de isolerade folliklarna manuellt med hjälp av en kalibrerad mikrokapillärpipett under mikroskopförstoring. Om folliklar fortfarande finns i vävnadsbitarna avslutas proceduren med manuell mikrodissektion. Folliklarna samlas på is i ett odlingsmedium och sköljs två gånger i droppar fosfatbuffrad saltlösning. Denna matsmältningsprocedur måste kontrolleras noggrant för att undvika försämring av follikeln. Så snart folliklarnas struktur verkar vara nedsatt eller efter högst 90 minuter stoppas reaktionen med en 4 °C blockerande lösning innehållande 10 % fetalt bovint serum. Minst 20 isolerade folliklar (storlek under 75 μm) bör samlas in för att erhålla en tillräcklig mängd totalt RNA efter RNA-extraktion för kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid (RT-qPCR). Efter extraktion når kvantifieringen av totalt RNA från 20 folliklar ett medelvärde på 5 ng / μL. Det totala RNA transkriberas sedan retrotranskriberat till cDNA, och generna av intresse analyseras vidare med RT-qPCR.
Introduction
Äggstocken är ett komplext organ som består av funktionella och strukturella enheter, inklusive folliklarna i cortex och stroma. Follikulogenes, processen för follikelaktivering, tillväxt och mognad från ett primordialt vilande tillstånd till en mogen follikel som kan befruktas och stödja tidig embryonal utveckling, studeras allmänt i forskning1. Att riva upp mekanismerna som driver detta fenomen kan förbättra fertilitetsvården för kvinnor2. Analyser av fast mänsklig vävnad gör det möjligt att bedöma proteinuttryck och genlokalisering inom äggstockens funktionella enheter 3,4. Emellertid behövs specifika tekniker för att dissociera folliklarna från den omgivande cortexen för att exakt bedöma genuttrycksnivåer inom äggstocksfolliklarna. I en tidigare studie utvecklades därför en follikelisoleringsteknik för att möjliggöra analyser av genuttryck direkt från den funktionella enheten i äggstocken5. Olika tillvägagångssätt har utvecklats, såsom enzymatisk nedbrytning och / eller mekanisk isolering, liksom laserinfångningsmikrodissektion, som möjliggör follikelisolering i en bit vävnad 6,7,8,9. Follikelisolering används i stor utsträckning, antingen med äggstocksvävnad från människa eller djur, för att utvärdera genuttrycksprofilerna för folliklar i alla utvecklingsstadier10,11,12. Ett optimalt isoleringsförfarande bör emellertid ta hänsyn till follikelns bräckliga struktur i den täta cortexen och bör därför utföras med försiktighet för att undvika skador7. Detta manuskript beskriver ett förfarande, anpassat från ett protokoll som beskrivs av Woodruffs laboratorium, för att isolera mänskliga folliklar från fryst tinad äggstocksbark för att utföra genuttrycksanalyser13.
Det första steget i isolering av äggstocksfollikeln från frusen mänsklig vävnad är upptiningsproceduren. Denna process utförs baserat på det kliniska protokoll som används för ympning av kryokonserverad äggstocksvävnad, som tidigare beskrivits14,15. Processen syftar till att avlägsna kryoprotektiva medel genom att skölja äggstocksbarken i minskande koncentrationer av mediet. Därefter fragmenteras vävnaden före enzymatisk och mekanisk isolering för att hämta folliklarna. Folliklar i olika stadier kan särskiljas med hjälp av ett stereomikroskop med hög förstoring och optik av god kvalitet för att isolera de av intresse. Varje isolerad follikel mäts med hjälp av en linjal integrerad i mikroskopet, och folliklarna kan slås samman enligt deras utvecklingsstadium: primordiala folliklar (30 μm), primära folliklar (60 μm), sekundära folliklar (120-200 μm) och antrala folliklar (>200 μm)16. Ytterligare klassificering kan utföras enligt folliklarnas morfologi: primordiala folliklar har ett lager av plana granulosaceller (GC), primära folliklar har ett lager av kuboidala GC, sekundära folliklar har minst två lager av kuboidala GC och närvaron av ett hålrum bland GC: erna kännetecknar antralstadiet. När folliklar av intresse väljs utförs RNA-extraktion. RNA-kvantiteten och kvaliteten utvärderas före kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid (RT-qPCR) (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Kryokonservering av äggstocksvävnad är ett lovande tillvägagångssätt för att bevara fertiliteten hos cancerpatienter. På kliniken ympas tinad kortikal vävnad tillbaka in i patienten efter remission, vilket möjliggör återupptagande av äggstocksfunktion och fertilitet19,20. Förutom klinisk användning kan kvarvarande äggstocksfragment också doneras för forskning i slutet av lagringsperioden för att studera mekanismerna som reglerar follikulogenes….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett Excellence of Science (EOS) bidrag (ID: 30443682). I.D. är associerad forskare vid Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).
Materials
| 2 mm gridded Petri dish | Corning | 430196 | |
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
| 2100 Expert software | Agilent | version B.02.08.SI648 | |
| 4-wells plate | Sigma Aldrich | D6789 | |
| 6-wells plate | Carl Roth | EKX5.1 | |
| Agilent total RNA 6000 pico kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes | Sigma Aldrich | A5177 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Collagenase IV | LifeTechnologies | 17104-019 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DNase | Sigma Aldrich | D4527-10kU | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| GoScript reverse transcriptase | Promega | A5003 | |
| HSA | CAF DCF | LC4403-41-080 | |
| Leibovitz-15 | LifeTechnologies | 11415-049 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes | LifeTechnologies | 12330-031 | |
| McIlwain tissue chopper | Stoelting | 51350 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm | CooperSurgical | 7-72-2200/1 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm | CooperSurgical | 7-72-2075/1 | |
| NanoDrop 2000/2000c operating software | ThermoFisher | version 1.6 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | 2000/2000c | |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | P3032 | |
| PowerTrack SYBR green master mix | ThermoFisher | A46109 | |
| Primers: GDF9 | F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG | ||
| Primers: HPRT | F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA | ||
| Primers: Kit Ligand | F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT | ||
| Real-Time qPCR Quantstudio 3 | ThermoFisher | A33779 | |
| RNAqueous-micro total RNA isolation kit | ThermoFisher | AM1931 | |
| Selenium | Sigma Aldrich | S9133 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Streptomycine sulfate | Sigma Aldrich | S1277 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
| Thermo Scientific Forma Series II water-jacketed CO2 incubators | ThermoFisher | 3110 | |
| Thomas Stadie-Riggs tissue slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | |
| Transferrin | Roche | 10652202001 |
References
- Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Annales d’Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).
- Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z. Progress in understanding human ovarian folliculogenesis and its implications in assisted reproduction. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (2), 213-219 (2013).
- Rosewell, K. L., Curry, T. E. Detection of ovarian matrix metalloproteinase mRNAs by in situ hybridization. Molecular Endocrinology. 590, 115-129 (2009).
- Tuck, A. R., Robker, R. L., Norman, R. J., Tilley, W. D., Hickey, T. E. Expression and localisation of c-kit and KITL in the adult human ovary. Journal of Ovarian Research. 8, 31 (2015).
- Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).
- Bonnet, A., et al. Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes during early follicular development obtained by laser capture microdissection. BMC Genomics. 12, 417 (2011).
- Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 71 (2017).
- Kim, E. J., et al. Comparison of follicle isolation methods for mouse ovarian follicle culture in vitro. Reproductive Sciences. 25 (8), 1270-1278 (2018).
- Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. 20 (6), 529-539 (2022).
- Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth. Molecular Human Reproduction. 28 (10), (2022).
- McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. Isolation of small preantral follicles from the bovine ovary using a combination of fragmentation, homogenization, and serial filtration. Journal of Visualized Experiments. (187), e64423 (2022).
- Schallmoser, A., Einenkel, R., Färber, C., Sänger, N. In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles in frozen thawed ovarian cortex tissue culture supplemented with follicular fluid under hypoxic conditions. Archives of Gynecology and Obstetrics. 306 (4), 1299-1311 (2022).
- Xu, M., et al. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Human Reproduction. 24 (10), 2531-2540 (2009).
- Demeestere, I., Simon, P., Englert, Y., Delbaere, A. Preliminary experience of ovarian tissue cryopreservation procedure: Alternatives, perspectives and feasibility. Reproductive Biomedicine Online. 7 (5), 572-579 (2003).
- Demeestere, I., et al. Ovarian function and spontaneous pregnancy after combined heterotopic and orthotopic cryopreserved ovarian tissue transplantation in a patient previously treated with bone marrow transplantation: Case report. Human Reproduction. 21 (8), 2010-2014 (2006).
- Gougeon, A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).
- Grosbois, J., Demeestere, I. Dynamics of PI3K and Hippo signaling pathways during in vitro human follicle activation. Human Reproduction. 33 (9), 1705-1714 (2018).
- Grosbois, J., Vermeersch, M., Devos, M., Clarke, H. J., Demeestere, I. Ultrastructure and intercellular contact-mediated communication in cultured human early stage follicles exposed to mTORC1 inhibitor. Molecular Human Reproduction. 25 (11), 706-716 (2019).
- Oktay, K., et al. Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm. Journal of the American Medical Association. 286 (12), 1490-1493 (2001).
- Chung, E. H., Lim, S. L., Myers, E., Moss, H. A., Acharya, K. S. Oocyte cryopreservation versus ovarian tissue cryopreservation for adult female oncofertility patients: A cost-effectiveness study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2435-2443 (2021).
- Walker, C. A., Bjarkadottir, B. D., Fatum, M., Lane, S., Williams, S. A. Variation in follicle health and development in cultured cryopreserved ovarian cortical tissue: A study of ovarian tissue from patients undergoing fertility preservation. Human Fertility. 24 (3), 188-198 (2021).
- Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. In vitro ovarian follicle growth: A comprehensive analysis of key protocol variables. Biology of Reproduction. 103 (3), 455-470 (2020).
- Rice, S., Ojha, K., Mason, H. Human ovarian biopsies as a viable source of pre-antral follicles. Human Reproduction. 23 (3), 600-605 (2008).
- Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
- Dong, F. -. L., et al. An research on the isolation methods of frozen-thawed human ovarian preantral follicles. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7 (8), 2298-2303 (2014).
- Lierman, S., et al. Follicles of various maturation stages react differently to enzymatic isolation: a comparison of different isolation protocols. Reproductive Biomedicine Online. 30 (2), 181-190 (2015).
- Abir, R., et al. Pilot study of isolated early human follicles cultured in collagen gels for 24 hours. Human Reproduction. 14 (5), 1299-1301 (1999).
- Abir, R., et al. Morphological study of fully and partially isolated early human follicles. Fertility and Sterility. 75 (1), 141-146 (2001).
- McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
- Abir, R., et al. Mechanical isolation and in vitro growth of preantral and small antral human follicles. Fertility and Sterility. 68 (4), 682-688 (1997).
- Vanacker, J., et al. Enzymatic isolation of human primordial and primary ovarian follicles with Liberase DH: Protocol for application in a clinical setting. Fertility and Sterility. 96 (2), 379-383 (2011).
- Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).
