Fysiologisk karakterisering af koralholobionten ved hjælp af et nyt mikrorespirometriværktøj

Summary

Denne protokol beskriver opsætningen og driften af et mikrorespirometrisystem, der kan anvendes til at undersøge de fysiologiske egenskaber ved koralholobiont.

Abstract

Metabolisk aktivitet, defineret som summen af organismeprocesser, der involverer energi, er af afgørende betydning for forståelsen af livets funktion og udvikling på jorden. Måling af organismers metaboliske hastigheder er derfor i centrum for at forklare organismers fysiologiske tilstande, deres økologiske roller og miljøpåvirkningernes indvirkning på arter inden for terrestriske og akvatiske økosystemer. På koralrev er målinger af metabolisme blevet brugt til at kvantificere symbiosefunktion mellem koraller og deres obligatoriske algesymbionter (Symbiodiniaceae) samt vurdere, hvordan miljømæssige stressfaktorer, herunder klimaændringer, vil påvirke korallernes sundhed. På trods af denne betydning mangler der metoder og derfor data vedrørende målinger af stofskiftehastighed hos koralafkom, sandsynligvis på grund af deres lille størrelse. For at afhjælpe dette hul havde denne undersøgelse til formål at udvikle en brugerdefineret opsætning til måling af respiration af små (millimeterstørrelsesområde) marine dyreøkologier. Denne lave pris og nemme opsætning skal give mulighed for forbedret måling af metabolisk hastighed. Dette vil være afgørende for anvendt økologisk forskning, der udnytter seksuel produktion af koraller til revrestaurering.

Introduction

Respiration er en kritisk biologisk måling, der signalerer en organismes samlede metaboliske aktivitet, men er ligesom andre kritiske træk (vækst) svær at måle i små organismer¹. Respiration kan defineres som oxidation af organiske molekyler ved brug af ilt. Denne proces genererer den kemiske energi, der er nødvendig for cellulær funktion (dvs. metabolisme), hvilket er afgørende for organismers overlevelse. Alternativt resulterer anaerob metabolisme i iltgæld². Respirationshastigheder kan bestemmes ved hjælp af optoder, der måler brugen (og derfor faldet) af iltkoncentration over tid i et lukket kammer, en praksis, der generelt er kendt som respirometri³. I betragtning af at størstedelen af organismer ikke lagrer ilt, kan metabolismehastigheden udledes gennem den direkte sammenhæng mellem åndedræt og kulstofforbrug. På grund af dette kan respirationshastigheder konverteres til daglig kulstofforbrug, hvilket informerer kritiske metaboliske funktioner som vækst, reproduktion og evnen til at opretholde metabolisk homeostase i tider med miljøbelastning ^4,5, herunder hedebølgeforhold, der generelt fører til stress eller blegning i koraller.

Koralrev falder globalt med en accelererende hastighed. Koraldyret huser et konsortium af partnere (herunder dinoflagellat, Symbiodiniaceae, svampe, bakterier og vira), samlet benævnt “holobiont”⁶. Når havtemperaturerne stiger, er koraller og derfor koralrev under stigende pres for at overleve, da høje temperaturer fører til tab af dinoflagellatet Symbiodiniaceae (herefter symbionter), et fænomen kendt som blegning⁷. Mange næringsstoffer er ellers utilgængelige for koraller i oligotrofe tropiske farvande, herunder uorganisk kvælstof og fosfor⁸. For at klare sig danner koraller en obligatorisk ernæringssymbiose med deres dinoflagellatsymbionter (Symbiodiniaceae), som giver størstedelen af de næringsstoffer, som koralværten har brug for for at overleve og deponere deres calciumcarbonatskeletter⁹. En fungerende symbiose kan karakteriseres ved høje niveauer af kulstofdeling mellem partnere^10,11, og reguleringen af symbiose involverer en dynamisk homeostase¹².

Under varmestress forstyrres denne dynamiske regulering og kommunikation, hvilket resulterer i dysbiose og blegning (gennemgået i reference¹³). Metaboliske målinger, såsom fotosyntese og respiration, har derfor potentialet til at belyse både korallernes sunde og uregulerede, dysbiotiske tilstande, og nøjagtigt måling af disse processer på tværs af ontogeni er afgørende for at forstå organismens funktion. Dette er især vigtigt, da hyppigheden og omfanget af masseblegningshændelser øges, med potentiale til at påvirke ændringer i næringsstofdeling fra symbionter, hvor kulstofoverførslen har vist sig at falde, når temperaturen stiger¹⁴. Dette kan skyldes rettede mekanismer af de symbionte sekvestrerende næringsstoffer eller fra hård-fysiologiske afvejninger (øget termisk tolerance, men et fald i værtsoverlevelse 15,16,17). Forstyrrelser i symbiose kan stamme fra både symbionten og værten, selvom en førende faktor sandsynligvis er den cellulære funktionsfejl i symbionten¹⁸. Imidlertid destabiliserer stress forårsaget af stigninger i havvandstemperaturer denne symbiose; Kulstofdeling fra symbiont til vært reduceres^19,20, og sult af korallen kan følge. Dette kan afspejles i formindskede lipid- og kulhydratlagre i koraller på grund af øget værtsbrug (“øget katabolisme af fast kulstof”), sandsynligvis på grund af formindsket deling af symbionter¹¹. Ved siden af bidraget fra fotosyntese og respiration af korallernes symbionter er respiration af koraldyret en vigtig foranstaltning til at forstå koralsundhed, virkningerne af blegning og næringsstofudveksling mellem disse partnere og væksten af holobiont, en fænotype, der er relevant for at overleve miljøændringer ^8,21,22. Endelig, da mange koraller er symbiotiske, er brugen af respirometri til at karakterisere fotosyntese ud over respiration særlig nyttig til kontekstualisering af P: R-forhold og forståelse af, om symbiosen er stabil eller ej (f.eks. Reference²³).

Miljøændringer forårsager derfor skift i korallens energibudgetter og dens symbionter, hvilket fører til forskelle i vækst¹⁴. For at klare sig kan koralværten øge åndedrættet og lipidforbruget for at imødekomme dets metaboliske krav; Varmestress kan reducere nettoproduktiviteten med 60% på grund af denne øgede respiration¹⁴, målt ved en ændring i opløst ilt. Symbiodiniaceae kan også øge kvælstofassimilering og kulstofretention^14,24 og derefter bruge disse reserver til at skifte energi mod deres egne reparations- og beskyttelsesmekanismer^25,26. Balancen mellem N og C er vigtig for at regulere væksten, og P især²⁷, hvilket kan manifestere sig som en dynamisk regulering af symbiont overflod. Faktisk tyder beviser indsamlet fra koraller på tværs af store revudvidelser (>1.000 km) på, at værter har kapacitet til at begrænse symbiontvækst gennem regulering af P, selvom dette varierer efter koralarter²⁷.

Samlet set tyder disse undersøgelser på en forøgelse af varmetolerance med et samtidig fald i enten produktion eller translokation af næringsstoffer (dvs. tilbøjelighed til symbiose) på grund af miljøændringer. Kraftfulde enkelt-juvenile metoder, såsom kvantificering af iltforbrug via mikrorespirometri, bør derfor bruges til at forstå de grundlæggende mekanismer i forbindelse med metabolisme og derefter anvendes til bevaringsspørgsmål såsom forståelse af varmetoleranceerhvervelse. Dette præsenteres her som et mikrorespirometriværktøj til fysiologiske målinger, der har til formål at stille spørgsmålstegn ved ernæringsforholdet mellem koralunge og deres algesymbionter, men egnet til andre små marine organismer.

Organismers brug eller produktion af ilt kan måles ved at placere dem i individuelle, hermetisk lukkede respirometrikamre eller ‘respirometre’ (herefter kamre), hvor iltændringen måles ved hjælp af optoder³. Optoder er sonder, der måler iltkoncentration ved hjælp af lysimpulser, og logning af målinger over tid muliggør beregning af respiration og / eller fotosyntesehastigheder. I praksis svarer måling af respiration til måling af fotosyntese i koraller, bortset fra at korallerne inkuberes i totalt mørke. At trække korallernes og symbionternes samlede daglige respiration fra den samlede daglige fotosyntese resulterer i en iltforskel (oxygendelta)^2,3. Generelt bruger organismer mere ilt, end de producerer, hvilket resulterer i et underskud. Dette kan omdannes til kulstofækvivalenter, da ilt og kulstof forbruges i et fast forhold². Kulstofoverskuddet kan bruges af korallen til vækst, slimsyntese og reproduktion og andre vigtige metaboliske behov¹².

Denne protokol beskriver en mikrorespirationsmetode (figur 1), der blev anvendt til måling af respirationshastigheder (R) for individuelle koralunger ved hjælp af et specialfremstillet 1,5 ml glaskammerdesign (hætteglas med GL25-gevind og 20 mm højt med bump/højderyg, fladjordskant og skruelåg med hul; se materialetabel) fyldt med 0,5 μm filtreret havvand. Fiberoptiske optoder (se materialetabel) blev indsat i hvert kammer gennem et hul i siden af låget. Hver enkelt koral blev fastgjort over en hårdmasket, gennemstrømningsrørerpladeplatform over en magnetisk omrøringsstang for at sikre tilstrækkelig blanding af vand i kammeret. I det repræsentative eksempel her blev to kontroller eller “blanks” (kamre, der var identiske bortset fra tilstedeværelsen af prøven) målt samtidigt til de tre replikate prøvekamre, da vi havde flere controllere, der kørte samtidigt. Opsætningseksemplet (figur 2) viser dog kun brugen af fire kanaler; Dette kan øges ved hjælp af flere controllere og flere gennemstrømningsstativer. Temperaturen kan også styres i dette system ved at nedsænke hvert kammer i et specialfremstillet vandbad med forudindstillede vandtemperaturer (27 °C til kontrol eller 31 °C til højtemperaturspændingen i eksempeldataene her) ved hjælp af et recirkulerende gennemstrømningssystem (kontinuerligt, skånsomt flow indstillet til 75 L/h). Omrørerpladeplatformen og omrørerpladen med gear kan være af enhver størrelse og kan laves så stor eller så lille som nødvendigt for at rumme antallet af glaskamre. I dette eksempel var platformen og pladen ca. 34 cm x 26 cm x 3 cm (materialetabel). Kalibrering af optoderne blev udført før hver kørsel under anvendelse af to standardopløsninger, der repræsenterer 0% og 100% iltmætning ved den passende vandtemperatur og saltholdighed til denne eksperimentelle indstilling.

Protocol

1. Opsætning af udstyr og koraller i respirationskamrene BEMÆRK: Reproduktivt klare koraller (dvs. dem, der havde lyserøde pigmenterede æg / sædbundter synlige fra fragmenterede grene fra arten Acropora tenuis-kolonier ) blev løsnet fra revet på Magnetic Island (19 ° 6.249’S; 146 ° 51.728’E) på dagen for fuldmåne i oktober 2018 (tilladelsesnummer: G12/35236.1), indsamlet og bragt ind i laboratoriet til koralgydning, hvor unge koraller blev opdrættet og dyrket. På måledagen forbindes de to vandbadeplader ved hjælp af blå polyrør og konnektorer (se materialetabel; Figur 1 [5], figur 2A, B). Disse vil fungere som inkubatorer efter tilslutning med den blå polypipe til vandvarmeren/køleren. Sørg for, at motorpladen tydeligt kan ses gennem de gennemsigtige vandbadsplader, når respirometrikamrene ikke er på plads. Tilslut de to slanger til vandvarmeren/køleren (se materialetabellen). Tænd for vandvarmeren/køleren, og indstil derefter den ønskede forsøgstemperatur (27 °C eller 31 °C). Tilslut bunden af vandbadet (trin 1.1) til basismotorpladen med magnetgearene (figur 1 [6, 7] og figur 3A), og tilslut derefter denne enhed til en strømkilde (figur 3B). Tænd for strømkilden for at aktivere gearene, som aktiverer omrørerstængerne i kamrene. Modulere vandgennemstrømningen efter behov (f.eks. kontinuerlig, skånsom strømning indstillet til 75 L/h under langsom omrøring ved 30 omdr./min.) ved hjælp af ventilforbindelsesknapperne (figur 3C). For at samle respirometrikammeret tilsættes magnetperlen (figur 1 [1.5]) til glaskammeret (figur 1 [1.6]) og derefter den uigennemsigtige plastgennemstrømningsstativbase (figur 1 [1.4]) ind i glaskammeret (figur 4A). Kammerets størrelse og den magnetiske perle afhænger af organismen og undersøgelsessystemet af interesse.BEMÆRK: Der er huller i plastbasen for at muliggøre vandgennemstrømning og cirkulation fra magnetperlens bevægelse i bunden. Lim korallen ved hjælp af akvarielim (se materialetabel) på den sorte lynlås, der er placeret i plastbasen (figur 4B-D). For at gøre dette skal du først lime koralungen på et stykke sort plast og derefter lime dette stykke på plastbasen. Når korallen er fastgjort sikkert (hærdning af limen er næsten øjeblikkelig), skrues låget med O-ringen (figur 4A) på glaskammeret. Udfør disse handlinger under vand i et separat bassin for at sikre, at der ikke er luft i respirometrikammeret.BEMÆRK: Vandmængden i respirometeret (dvs. effektivt volumen = 1,5 ml) blev bestemt ved fuldstændig nedsænkning af kammeret under vandet. Antagelsen er, at forskydningen fra massen/densiteten af den meget lille koral i forhold til vandmængden er ubetydelig. 1,5 ml mikrocentrifugerøret er vist her for skala (figur 4A). Anbring kamrene fast i vandbadene (figur 5A). Sørg for, at glaskamrene er i kontakt med det temperaturstyrede vand til forsøget. TilslutO2 fiberoptiske kabler (se Materialetabel), så de er i kontakt med iltfølerpletterne (i det følgende benævnt pletter; se Materialetabel) ved at indsætte dem i hullet, der er boret ind i siden af lågkamrene. Disse små pletter er iltfølsomme og registrerer og transmitterer signalet inde fra kammeret gennem det fiberoptiske kabel.Tilføj VVS-tape (hvidt tyndt selvforseglende tape) for at få kablet til at sidde tæt og for at lade det forblive fast inde i vandkammeret. Sørg for, at den enkelte koral kan ses (som vist i figur 5B) med brune tentakler opad inde i kammeret (figur 5B, video 1).BEMÆRK: Omkostningsoverslag for komponenterne i apparatet findes i tabel 1. 2. Standardprocedure for måling af åndedræt ved hjælp afO2-systemet Åbn iltmålingssoftwaren (se materialetabellen). Mål temperaturen i det rum, hvor kalibreringen skal udføres. Dette vil være nødvendigt senere for kalibreringstrinnet (trin 2.8). Saml de optiske sensorer og hætter. For at gøre dette skal du tilslutte al fiberoptik til den matchende port iO2-modulet . Sørg for at matche hætte 1 med sensor 1, hætte 2 med sensor 2 osv. For at indstille kamrene til kalibrering skal du først fugte et stykke ren svamp med lidt omvendt osmose (RO) vand og indsætte det i hvert kammer.BEMÆRK: Svampen må ikke dryppe, kun være fugtig. Det kan dryppe på det fiberoptiske sted. Sørg for, at stedet ikke er vådt, før du fortsætter til næste trin. Placer kamrene på hovedet med den matchende fiberoptik (figur 6). Dette gør det muligt at skrue kammeret af uden at røre fiberoptikken og tilsætte natriumsulfitten til 0% kalibrering. Kontroller signalet for hver sensor, før kalibreringen starter. Gå gennem alle fanerne i softwaregrænsefladen, og kontroller signalværdien (øverste venstre hjørne) (figur 7A), og sørg for, at de ikke varierer betydeligt. SeO2-manualen for de acceptable værdier for den eksperimentelle opsætning (afhængigt af organismen og betingelserne af interesse). Til denne specifikke opsætning er en FTC (oxygen sensor spot flow through cell normal range) på 20,59 med signalet ved 179,5 acceptabel ved en stuetemperatur på 25,3 °C. Åbn Program , og kontroller indstillingerne i softwaren for at bekræfte, at de er korrekte som beskrevet nedenfor. Hvis pop op-vinduet ikke vises umiddelbart efter åbning af programmet, kan dette gøres ved at klikke på knappen Indstillinger i nederste venstre hjørne af softwaregrænsefladen. Kontroller, at den eksterne temperatursensor er aktiveret (figur 7B). Skift indstillingen til Fast temperatur (figur 7C). Tilføj derefter rumtemperaturværdien, og klik på kopiér indstilling til alle andre kanaler. Skift indstillingen for at reducere signalafvigelse (figur 7C). Vælg derefter Sensorindstillinger , og vælg niveau 2. Ellers, hvis du bruger små mængder, vil driften være så høj, at det vil være svært at kalibrere. Kontroller kanalernes generelle indstillinger. Tryk på OK , hvis det er relevant. Klik på kopiér indstillinger til alle kanalerne, og klik derefter på ok. Kalibrer sensorerne. For kalibrering af kanal 1 skal du gå til fanen Kanal 1 og trykke på knappen Kalibrer . Vælg 2-punkt i vand eller fugtig luft. Til “luft” kalibrering dyppes et stykke skum i vand, placeres inde i kammeret, og vent på, at signalet stabiliseres (se før og efter luftkalibreringsbilleder). Når den er stabil, skal du trykke på “sæt luft”. Klik på luft > Kalibrer > indstil luft. Indstil 0% og 100% kalibrering (figur 7D). Fjern kammeret fra hætten, og placer det i den næste hætte, så luftkalibreringssignalet er klar, når 0%-kalibreringen i den første sensor er færdig. Brug en overførselspipette og fyld hætten med 2% natriumsulfit. Vent på, at signalet stabiliseres.BEMÆRK: Signalet tager normalt længere tid at stabilisere sammenlignet med luftkalibreringen. Hvis der vises en advarselsmeddelelse, der siger, at “værdierne er uden for typisk interval”, skal du sørge for, at natriumsulfitten er frisk. Gentag den samme kalibreringsproces for alle kanalerne. Forbered natriumsulfitten ved at tilsætte 2 g i 100 ml RO-vand. Når kalibreringen er afsluttet, skylles respirationskamrene godt, og kamrene og hætterne tørres. Sørg for, at der ikke er vand i det fiberoptiske hul. Placer organismen (enkelte koralunger i dette eksempel) inde i åndedrættet og luk med låg. Når du placerer lågene, skal du sørge for at gøre det, når kamrene er helt nedsænket, og der absolut ikke er luft indeni. Placer kamrene fast i omrøringspladen, og tilslut fiberoptikken. Tænd for strømforsyningen. Sørg for, at vandet inde i kamrene bliver blandet helt. Indstil temperaturen i køleren/varmelegemet til de valgte forsøgstemperaturer. Tænd for pumpen og varmeapparatet (trin 1.2 og 1.4). Tryk på log påO2-målesoftwarens grænseflade for at starte optagelsen.

Representative Results

Databehandling og -analyseSelvom der er mange metoder til at behandle rådata fra respirometrieksperimenter, anbefales det at bruge R-pakken respR28. I overensstemmelse med delingen af protokollerne ovenfor, som går ind for åben videnskab og reproducerbarhed, gør denne pakke det muligt at dele databehandling og analyse i en let reproducerbar form og er designet med det i tankerne. Det er en gratis, open source-platform og sondesystemagnostisk og let installerbar enten fra CRAN eller GitHub. Fuld kode og eksempler til respR vedligeholdes og kan findes på https://github.com/januarharianto/respR. respR-pakken har funktioner til at importere, visualisere og udføre kvalitetskontrol på respirometridata og til at beregne respirationshastigheder enten automatisk eller fra manuelt valgte regioner. Det kan også justere satser for baggrundsrespiration og konverteringsfrekvenser til almindeligt anvendte outputenheder. Trinene til behandling af dataene fra mikrorespirometrisystemet er beskrevet nedenfor. I denne undersøgelse blev dataene fra respirometrisystemet brugt som et eksempel, men pakken accepterer også input fra størstedelen af kommercielt tilgængelige iltsondesystemer samt generiske R-dataobjekter. Flere detaljer om pakken, herunder fuld dokumentation og tutorials, kan findes på pakkens websted på https://januarharianto.github.io/respR/index.html. Import af rådataDen rå outputfil (.txt) importeres. respR genkender formatet og analyserer det til en generisk R-dataramme, der kan bruges i efterfølgende funktioner. Det er dog vigtigt at bemærke, at dette er valgfrit; disse filer og stort set alle ilttidsseriedata kan også importeres ved hjælp af basisfunktioner (angivet nedenfor) af alle med et grundlæggende kendskab til R. #load respRBibliotek(respR) #Import —Data <- import_file("file.txt")#Firesting-Pryo-fil fundet Inspektion og visualisering af dataeneEn vigtig del af enhver dataanalyseopgave er at plotte og inspicere dataene for at lede efter åbenlyse anomalier eller mønstre eller endda bare hjælpe med at forstå dem. Inspektionsfunktionen bruges her (figur 8A), som kontrollerer for problemer, der er fælles for respirometridata, såsom ikke-numeriske eller manglende værdier. #inspect en enkelt iltsøjleInsp <-inspect (data, tid = 3, ilt = 8, bredde = 0,2) Denne funktion plotter også ilttidsserien og beregner en rullende hastighed (nederste panel) for at hjælpe med at belyse, hvordan denne hastighed kan ændre sig i løbet af eksperimentet. Disse diagrammer med rullende hastighed hjælper med at informere om, hvilke regioner af disse rentekurver der skal udtrækkes. I tilfælde af standard eller rutinemæssige metaboliske hastigheder er de ønskede regioner dem, hvor hastigheden viser stabilitet (f.eks. Efter omkring tidspunktet 3.000; Figur 8B). Her bliver faldende ilt først detekterbart efter omkring række 200 i hele tidsseriepanelet. Mønstre som dette er meget almindelige i respirometridata; Der er ofte en længere periode med ustabilitet i starten af et eksperiment, da systemet stabiliseres, og prøven bliver akklimatiseret til de eksperimentelle forhold. Det anbefales, at satser kun udtrækkes fra tidsserien efter denne indledende ustabilitet, hvilket også fremhæver vigtigheden af visualiseringer. Uddrag satserrespR har to funktioner til ekstraktion af respirationshastigheder. Den første er calc_rate () -funktionen, som gør det muligt at ekstrahere en hastighed manuelt ved at angive et område af tid, række eller iltniveau. Dette er meget almindeligt i respirometrianalyser og en helt acceptabel metode til fastsættelse af en sats, så længe udvælgelseskriterierne fastlægges og anvendes konsekvent28. En mere robust og objektiv måde er at bruge funktionen auto_rate(), som identificerer lineære områder af dataene. Disse områder er områder med konsekvent vedvarende respirationshastigheder, der tildeles automatisk ved hjælp af maskinindlæring. Denne funktion er også nyttig til påvisning af lave signaler (som i prøverne, der anvendes i denne aktuelle undersøgelse på grund af den lave biomasse i denne alder). Denne funktion gør det muligt at identificere de mest lineære, minimale og maksimale satser ved hjælp af uafhængige, objektive og statistisk robuste metoder28. Eksemplet her identificerer et lineært område, der forekommer fra omkring tidspunkter 3.000 til 5.000. Det skal bemærkes, at flere lineære regioner kan identificeres, men dette afsnit er den højest rangerede eller mest lineære region (figur 8C). #Determine mest lineære (dvs. konsistente) hastighedKurs <-auto_rate(INSP) Justering af baggrundBaggrundshastigheder fra kontroleksperimenter kan bestemmes på samme måde som ovenstående eksempel og kan bruges til at justere prøvehastighederne ved hjælp af funktionen adjust_rate() (figur 9A; bemærk, at den fulde analyse ikke vises her, kun justeringen). Alle eksempler er detaljeret på respR-webstedet . #Adjust sats for baggrundrate_adj <-adjust_rate(hastighed, med = bg) #saved bg-objekttryk(rate_adj) Konverter satserDet sidste trin er at konvertere hastighederne til de ønskede outputenheder ved hjælp af de originale enheder af rådataene, respirometrets effektive volumen og andre eksperimentelle data, herunder normalisering til blinde målinger (figur 9B). Udgangen kan være en absolut respirationshastighed, det vil sige af hele prøven eller en masse- eller overfladearealspecifik hastighed. Den overfladearealspecifikke hastighed var det output, der blev brugt her, hvilket specifikt er den absolutte hastighed divideret med prøvens overfladeareal (figur 9C). Som diskuteret ovenfor blev dette system udviklet til at måle meget små prøver. Derfor forventede vi lave værdier og potentiel overlapning med tomme målinger. Der forventes et vist signalniveau inden for emnerne, og når de undersøges, ligger disse værdier inden for det forventede område for generel eksperimentel støj, muligvis på grund af sondedrift, små temperaturændringer eller bobler på sonderne. Ved design og på grund af den lille prøvestørrelse og derfor lille effektive volumen, der anvendes, er brugen af emner særlig vigtig her, især for hvert løb. Repræsentative værdier er medtaget her som et eksempel (figur 10). I betragtning af den lille prøvestørrelse anbefaler vi brugen af emnerne ved hver kørsel for at standardisere målinger pr. Kørsel. Disse blindværdier bruges derefter til at standardisere måleværdier for behandlingen. Da koraller respirerer ud over at producere ilt, kan stofskiftet variere fra negative til positive værdier. Et eksempel på repræsentative resultater af rækken af respirationsværdier detekteret fra mikrorespirationsværktøjet er givet her. Disse resultater blev bestemt ud fra et vellykket eksperiment på enkelte koralunger (figur 10). Samlet set forventedes respiration at være vanskelig at påvise i dette eksempeldatasæt (ved design) på grund af prøvernes lille størrelse; Dette understreger værdien af denne metode til at fange denne lave signaltærskel. Disse repræsentative resultater viser åndedræt i mørke ved de mindste testede prøvestørrelser, hvilket understreger minimumsdetektionstærsklen for dette system. Vi målte også under to forhold (kontrol og høj temperaturspænding). Efter standardisering til blindprøver målt pr. kørsel varierede værdierne fra tæt på nul (kontrol) til en median på ~-5e-5 for stressbehandlingen. Som forventet var åndedrættet lavt. Disse resultater viser tydeligt repræsentative værdier for blindprøver samt en sammenligning mellem kontrol og høj temperatur for disse meget små prøver. Figur 1: Skematisk gengivelse af det nye mikrorespirometriværktøj til fysiologisk karakterisering af koralholobionten (koraldyr + symbionter) eller enhver lille organisme (<1 mm). Brugerdefinerede respirometrikamre blev lavet (nummer 1; 1.1-1.6). Disse omfatter låg (1.1) med iltfølerpletter (1.2), og den enkelte unge (1.3) anbringes på et gennemstrømningsstativ (1.4) anbragt oven på en magnetisk omrører (1.5), som alle passer ind i glaskammeret (1.6). Controlleren (2) er fastgjort til stedet med et fiberoptisk kabel, der passer ind i låget (1) og tilsluttet computeren (3). Varmeapparatet/køleren (4) tilsluttes respirometripladen (5) med gennemstrømningsvandet (angivet med vinkelpile for retning), som sidder oven på omrørerpladen (6) med gear (7), drevet af motoren (8) og strømforsyningen (9). Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 2: Opsætning af mikrorespirometri. Flere muligheder er tilgængelige, herunder (A) en respirometriplade eller (B) forbundet til flere plader. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 3: Specialbygget magnetisk omrørerplade oven på respirometripladen. Hvert kammer har (A) et magnetisk omrørergear nedenunder, (B) drevet af en motor, med (C) respirometripladen forbundet med varmeapparatet/køleren ved hjælp af slangen. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 4: Brugerdefineret opsætning af respirometrikammer. (A) Komponenter (fra venstre mod højre: låg, hætteglas, stativ, 1,5 ml slange til skala og omrørerstang). (B) Individuelt gennemstrømningsstativ, som prøven sidder i. C) Set oppefra og ned af gennemstrømningsstativet. (D) og med stativet placeret inde i hætteglasset med låget skruet på. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 5: Hætteglas af glas placeret i omrørerpladen. (A) Specialbygget omrørerplade med (B) et nærbillede af hele hætteglasset med lågopsætning. Den unge koral kan ses gennem låget her (brun prik), oven på lynlåsen, med fiberoptikken placeret i lågåbningen. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 6: Kamre placeret på hovedet, klar til kalibrering. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 7: Vigtige trin i iltmålingssoftwaren. (A) Kontroller signalet fra hver sensor. Et optimalt signal til denne undersøgelse og sensorer vises i iltsensorspottet FTC (normalområde). (B) Kontroller signalafvigelsen. (C) Indstil og kontroller behandlingstemperaturerne. (D) Indstil og kontroller 0% og 100% kalibreringerne. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 8: respR-analyse output trin I. (A) Undersøg kommando og output. (B) Kontroller kursstabiliteten. (C) Bestem den mest lineære hastighed. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 9: trin i resultaterne af respR-analysen II. (A) Juster hastigheden for baggrund, (B) Konverter og (C) kontroller satserne. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 10: Repræsentative resultater fra mikrorespirometriværktøjet. Median respiration (O2 ± standardfejl) af replikate individuelle koralungfisk, herunder blindværdier samt respiration af individer under kontrol og stressforhold ved høje temperaturer. Klik her for at se en større version af denne figur. Video 1: Top-down visning af respirometri kammeret med den unge koral inde under en målesession. Klik her for at downloade denne video. Tabel 1: Omkostningsoverslag over komponenter i respirometriapparatet. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Dette arbejde skitserer konstruktionen af en skræddersyet mikrorespirometriopsætning, der kan bruges til at kvantificere mængden af ilt, der forbruges og produceres af små sessile vandorganismer. De kritiske komponenter i denne protokol omfatter opsætning af kamrene, herunder pletterne, og kalibrering af det lave signal ved hjælp af respR-pakken , hvor et lavt signal kan defineres som hastigheder, der er kendetegnet ved lave eller støjende skråninger. Specialkammeret og dets opsætning gør det muligt at detektere selv lave signaler, mens brugen af R-pakken hjælper med at beskytte mod problemer, hvor forekomsten af lavvandede eller støjende skråninger kan føre til fejlfortolkning af resultater (f.eks. falske positiver).

Potentielle ændringer, der vil være nødvendige for andre brugere, omfatter sikring af organismen af interesse inden for det specialfremstillede kammer. I dette tilfælde blev en lille, stiv lynlås og akvarielim brugt til at fastgøre den enkelte unge til plastbasen, som derefter blev limet til slipset. Det skal bemærkes, at koralunge til dette eksperiment blev afgjort på sort plastfolie. Denne plastik tillod let fjernelse af koralungerne, som effektivt gled af plasten for ikke fysisk at skade dem under fjernelsen. Koralunge fastgøres til det substrat, de sætter sig på, så det anbefales at afregne dem på lignende plastmateriale ved hjælp af et kunstigt peptid¹⁶ for at lette deres fjernelse til limningsprocessen. For yderligere at minimere håndteringsstress og indvirkning på respirationsresponsen anbefales det at lade korallerne monteret på lynlåsbånd akklimatisere sig i 1-2 uger, som det er almindeligt i mange voksne koralstresseksperimenter. Andre ændringer kan være nødvendige for at sikre organismen over stedet i låget og for at muliggøre vandcirkulation. Et andet vigtigt fejlfindingstrin involverer signaldetektion, specifikt på hældningen af ilttidsserien, hvor hastigheder skal bestemmes. I sidste ende kommer dette ned til en kombination af at bruge god dømmekraft til at udelukke åbenlyst ustabile data og funktionerne inden for respR for at gøre det muligt at udtrække satser fra enten konsekvent valgte regioner eller automatisk ved at identificere lineære regioner af dataene. Yderligere eksempler på, hvordan dette kan gøres, findes på respR-webstedet .

Denne metode blev udviklet til at udvide målinger af den nedre grænse for åndedræt til ekstremt små, siddende marine hvirvelløse dyr. Den åbenlyse begrænsning er, at denne protokol kan være mere tilbøjelig til falsk-positive sammenlignet med protokoller designet til større biomasser. Men da dette var meningen med designet – at måle disse nedre grænser – er dette blevet indregnet i designet, og proceduren kan bruges sammen med respR-pakken for bedre at beskytte mod falske positiver. Det er også vigtigt at erkende, at der findes andre systemer til måling af respiration³⁰ og måling af små organismer, herunder respirometri på individuelle vandlopper³¹ i mindre mængder end dette (~0,5-1 ml), men som enten er dyre eller mangler specifikke komponenter (omrøringsevne). Dette system er imidlertid open source og relativt billigt sammenlignet med kommercielle systemer (f.eks. Core Microplate-system). Dette system inkorporerer også vigtige metodologiske overvejelser som omrøring, som andre systemer kan mangle. Den interne omrøringsstangfunktion er afgørende for at replikere den naturlige vandblanding af mange marine organismer (f.eks. Vandlopper via svømning), hvilket ofte ikke er muligt og kan gøre dataene stort set ubrugelige. I modsætning hertil involverer andre tilgængelige blandingsmetoder at placere hele respirometeret på en kæmpe vippebænk, hvilket kræver ekstra udstyr og har begrænset succes med blanding eller blanding via vibrationer, hvilket kan forårsage forstyrrelse af organismen. Af denne grund er dette det eneste system, der kan udføre respirometri på unge koraller eller andre meget små sessile organismer. Som reference varierede størrelsesintervallet for de prøver, der er inkluderet her, fra 2,1 til 3,6 polypper (svarende til kun få måneder gamle) med et minimum til maksimalt middelareal på 1,3 til 4,5 mm².

Respirometri er en grundlæggende foranstaltning i økologiske undersøgelser, og der findes mange metoder til dette formål. De fleste af disse eksisterende metoder er imidlertid rettet mod prøver med høj biomasse, herunder hele fisk, koralfragmenter eller havgræsser 32,33,34. Denne metode er den første til at bruge individuelle koralunge. Derudover er der mange potentielle anvendelser for denne metode, da den giver vigtige fysiologiske oplysninger om organismens funktion. Dette kan være vigtigt for undersøgelser, der søger at karakterisere baseline sundhedsestimater³⁵, forstå rollen som akut eller langvarig stress under koralontogeni såsom varmestress³⁶ eller at give tærskler, som ledere kan indstille for at hjælpe med at beskytte og forbedre koralrevets sundhed³⁷. I betragtning af at korallen er en holobiont, og symbiontsamfundet er relativt fleksibelt på dette stadium og i hele det første leveår³⁸, ville det være interessant at parre respirometridata med ændringer i samfund over tid for fuldt ud at kontekstualisere organismens funktion som helhed. Det er vigtigt, at denne metode bidrager til ‘åben videnskab’ teknikker, der hjælper med at give en oversigt til oprettelse af brugerdefinerede eksperimentelle opsætninger, der kan deles, forbedres og standardiseres åbent.

Materials

			Cost
(1.1 – 1.6) Custom respirometry chambers	LabGlass Party Ldt.	1.5 ml	$407.26
1.1 lids	AIMS workshop	Vial GL25 thread	~$10
1.2 fiber-optics spots (FireStingO2 II fiberoptic optodes)	PyroScience	Oxygen sensor spots, 125 µm PET foil, Ø5 mm, with optical isolation, SN: 183801947	$41.25 AUD each
1.3 individual organism	NA	NA	NA
1.4 flow-through stand	AIMS workshop	Custom	included in points 5 and 6 price (the workshop gave me an estimate of the lids, stand with gears, motor, incubation flow through
1.5 magnetic stirrer	Any manufactuer is suitable	NA	~$2?
1.6 glass chamber (vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole, Labglass Pty Ltd, Stafford QLD)	Labglass Pty Ltd, Stafford QLD	Vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole	$50.9 AUD
2 FireSting controller (2)	PyroSciences	NA	4 sensors is 4000 Euros. 8 sensors used here.
3 computer	NA	NA	NA
4 heater/chiller	VWR International	NA	Small models around $4,000 AUD
5 respirometry plate platform	AIMS workshop	34 cm x 26 cm x 3 cm (although any dimensions are adequate to fit desired number of chambers)	$1250 AUD
6 stirrer plate with gears (7)	AIMS workshop	34 cm x 26 cm x 3 cm	$1250 AUD
8 powered by the motor	AIMS workshop	Custom	$700 AUD
9 power supply	Non-specific	NA	~$300 AUD
Aquarium glue	Seachem reef glue	20g	$14
Oxygen Logger Software	PyroScience	NA	NA
Polypipe and connectors	John Guest	NA	$20
Sodium Sulfite	Sigma	S0505-250G (CAS number 7757-83-7)	$54