このプロトコルでは、サンゴのホロビオントの生理学的特徴を調査するために使用できるマイクロスピロメトリーシステムのセットアップと実行について説明します。
代謝活動は、エネルギーを含む生物のプロセスの合計として定義され、地球上の生命の機能と進化を理解する上で非常に重要です。したがって、生物の代謝率を測定することは、生物の生理学的状態、それらの生態学的役割、および陸生および水生生態系内の種に対する環境変化の影響を説明する中心にあります。サンゴ礁では、サンゴとその義務的な藻類共生生物(Symbiodiniaceae)との間の共生機能を定量化し、気候変動を含む環境ストレス要因がサンゴの健康にどのように影響するかを評価するために、代謝の測定が使用されてきました。この重要性にもかかわらず、サンゴの子孫の代謝率測定に関連する方法、したがってデータが不足しており、おそらくサイズが小さいためです。このギャップに対処するために、本研究は、小さな(ミリメートルサイズの範囲)海洋動物の生態の呼吸を測定するためのカスタムセットアップを開発することを目的としていました。この低コストでセットアップが簡単なため、代謝率の測定が改善されるはずです。これは、サンゴ礁の回復のためにサンゴの有性生産を利用する応用生態学的研究に不可欠です。
呼吸は、生物の全体的な代謝活動を示す重要な生物学的測定値ですが、他の重要な形質(成長)と同様に、小さな生物では測定が困難です1。呼吸は、酸素の使用による有機分子の酸化として定義できます。このプロセスは、生物の生存に不可欠な細胞機能(代謝)に必要な化学エネルギーを生成します。あるいは、嫌気性代謝は酸素負債2をもたらす。呼吸数は、密閉チャンバー内での酸素濃度の経時的な使用量(したがって減少)を測定するオプトードを使用して決定でき、一般にレスピロメトリー3として知られています。大多数の生物が酸素を蓄えていないことを考えると、代謝速度は呼吸と炭素使用量の直接的な相関関係から推測できます。このため、呼吸数は毎日の炭素使用量に変換でき、成長、繁殖、および一般的にサンゴのストレスや白化につながる熱波条件を含む環境ストレス4,5の時期に代謝恒常性を維持する能力などの重要な代謝機能に情報を提供します。
サンゴ礁は世界的に加速度的に減少しています。このサンゴ礁には、渦鞭毛藻の共生虫科、菌類、細菌、ウイルスなどのパートナーが生息しており、総称して「ホロビオント」と呼ばれています6。海水温が上昇すると、高温は渦鞭毛藻の共生虫(以下、共生生物)の喪失につながるため、サンゴ、ひいてはサンゴ礁は生き残るための圧力が高まっています。貧栄養熱帯水域のサンゴには、無機窒素やリンなど、多くの栄養素が利用できない8。これに対処するために、サンゴは渦鞭毛藻の共生生物(Symbiodiniaceae)と義務的な栄養共生を形成し、サンゴの宿主が生き残り、炭酸カルシウムの骨格を堆積させるために必要な栄養素の大部分を提供します9。機能的な共生は、パートナー間の高レベルの炭素共有によって特徴付けられる可能性があり10,11、共生の調節には動的なホメオスタシス12が含まれます。
暑熱ストレスの間、この動的な調節と伝達が中断され、嚥下障害と漂白が起こります(参考文献13でレビュー)。したがって、光合成や呼吸などの代謝測定は、サンゴの健康な状態と調節されていない非細菌叢状態の両方を解明する可能性を秘めており、個体発生全体にわたってこれらのプロセスを正確に測定することは、生物の機能を理解する上で重要です。これは、大量の白化現象の頻度と規模が増加するにつれて特に重要であり、気温が上昇するにつれて炭素移動が減少することがわかっている共生生物からの栄養分担の変化に影響を与える可能性があります14。これは、共生生物が栄養素を隔離するメカニズムによるものか、またはハード生理学的トレードオフ(熱耐性は向上するが宿主の生存率は低下する)によるものかも知れない15,16,17。共生の破綻は共生生物と宿主の両方に起因している可能性があるが、その主な要因は共生生物の細胞機能不全である可能性が高い18。しかし、海水温の上昇によるストレスは、この共生を不安定にします。共生生物から宿主への炭素分担は減少し19,20、サンゴの飢餓が続く可能性があります。これは、宿主の使用量の増加(「固定炭素の異化作用の増加」)によるサンゴの脂質と炭水化物の貯蔵の減少に反映されている可能性があり、おそらく共生生物による共有の減少が原因である11。サンゴの共生生物の光合成と呼吸の貢献と並んで、サンゴ動物の呼吸は、サンゴの健康、これらのパートナー間の白化と栄養素交換の影響、および環境変化を生き残ることに関連する表現型であるホロビオントの成長を理解するための重要な尺度です8,21,22.最後に、多くのサンゴが共生していることを考えると、呼吸に加えて光合成を特徴付けるためのレスピロメトリーの使用は、P:R比を文脈化し、共生が安定しているかどうかを理解するのに特に役立ちます(例えば、参考文献23)。
したがって、環境の変化はサンゴとその共生生物のエネルギー収支に変化を引き起こし、成長の違いにつながります14。対処するために、サンゴの宿主は、その代謝要求を満たすために呼吸と脂質の使用量を増やすことができます。熱ストレスは、溶存酸素の変化によって測定されるこの呼吸の増加により、正味の生産性を60%低下させる可能性がある14。また、共生動物は窒素同化と炭素保持を増加させ14,24、これらの蓄えを利用してエネルギーを自身の修復と保護のメカニズムにシフトさせる可能性があります25,26。NとCのバランスは成長を調節するために重要であり、特にPは27であり、共生生物の個体数の動的な調節として現れる可能性がある。実際、広大なサンゴ礁(>1,000 km)のサンゴから収集された証拠は、サンゴの種類によって異なるものの、宿主がPの調節を通じて共生生物の成長を制限する能力を持っていることを示唆しています27。
まとめると、これらの研究は、環境の変化による栄養素の生産または移動(すなわち、共生傾向)のいずれかの同時進行の減少を伴う熱耐性の獲得を示唆しています。したがって、マイクロスピロメトリー による 酸素使用量の定量化などの強力な単一稚魚法を使用して、代謝に関連する基本的なメカニズムを理解し、耐熱性の獲得の理解などの保存の問題に適用する必要があります。これは、サンゴの稚魚とその藻類共生生物の間の栄養関係を調査することを目的とした生理学的測定のためのマイクロスピロメトリーツールとしてここで紹介されていますが、他の小さな海洋生物に適しています。
生物による酸素の使用または生成は、それらを個々の密閉された呼吸測定チャンバーまたは「呼吸計」(以下、チャンバー)に入れることによって測定でき、酸素変化はオプトード3を使用して測定されます。オプトードは、光パルスを使用して酸素濃度を測定するプローブであり、時間の経過に伴う測定値を記録することで、呼吸速度や光合成速度を計算できます。実際には、呼吸の測定はサンゴの光合成の測定に似ていますが、サンゴが完全な暗闇で孵化することを除いて。1日の光合成総量からサンゴと共生生物の1日の総呼吸数を差し引くと、酸素差(酸素デルタ)が生じます2,3。一般に、生物は生成するよりも多くの酸素を使用するため、欠乏が生じます。これは、酸素と炭素が一定の比率で消費されるため、炭素当量に変換できます2。余剰炭素は、サンゴの成長、粘液の合成と繁殖、およびその他の重要な代謝ニーズに使用できます12。
このプロトコルでは、0.5 μmのろ過海水で満たされたカスタムメイドの1.5 mLガラスチャンバー設計(GL25スレッド、高さ20 mmのバイアル、バンプ/リッジ、平らな地面のリム、穴付きのスクリューキャップ、材料表を参照)を使用して、個々のサンゴの稚魚の呼吸速度(R)を測定するために採用されたマイクロ呼吸法(図1)について説明します。光ファイバーオプトード(材料表参照)を蓋の側面の穴から各チャンバーに挿入した。個々のサンゴは、チャンバー内の水が適切に混合されるように、磁気攪拌棒の上の硬いメッシュのフロースルースターラープレートプラットフォームの上に取り付けられました。ここでの代表的な例では、複数のコントローラーを同時に実行していたため、2つのコントロールまたは「ブランク」(試料の存在以外は同一のチャンバー)を3つの複製試料チャンバーと同時に測定しました。ただし、セットアップ例(図2)では、4つのチャネルの使用のみを示しています。これは、複数のコントローラーと複数のフロースルースタンドを使用して増やすことができます。このシステムでは、再循環フロースルー(75 L/hに設定された連続的で穏やかな流量)システムを使用して、あらかじめ設定された水温(制御の場合は27°C、高温応力の場合は31°C)で各チャンバーをカスタムメイドの水槽に浸すことによって、温度を制御することもできます。攪拌板プラットフォームと歯車付き攪拌板は、任意のサイズにすることができ、ガラスチャンバーの数に対応するために、必要に応じて大きくまたは小さくすることができます。この例では、プラットフォームとプレートは約34 cm x 26 cm x 3 cmでした(材料表)。オプトードのキャリブレーションは、この実験設定に適した水温と塩分濃度で酸素飽和度が 0% と 100% を表す 2 つの標準溶液を使用して、各分析の前に実行しました。
この研究は、小さな固着性水生生物によって消費および生成される酸素の量を定量化するために使用できるカスタムメイドのマイクロスピロメトリーセットアップの構築について概説しています。このプロトコルの重要な要素には、スポットを含むチャンバーのセットアップと、 respR パッケージを使用した低信号の較正が含まれ、低信号は浅いまたはノイズの多いスロープに代表されるレートとして定義できます。カスタムチャンバーとそのセットアップにより、低信号でも検出でき、Rパッケージの使用により、浅いスロープやノイズの多いスロープの発生が結果の誤った解釈(誤検知など)につながる可能性のある問題から保護されます。
他のユーザーに必要となる可能性のある変更には、カスタムメイドのチャンバー内で目的の生物を確保することが含まれます。この場合、小型で硬い結束バンドと水槽用接着剤を使用して、1匹の稚魚をプラスチックベースに固定し、ネクタイに接着しました。なお、この実験では、サンゴの稚魚を黒いビニールシートの上に定着させました。このプラスチックにより、サンゴの稚魚を簡単に取り除くことができ、プラスチックから効果的に滑り落ち、除去中にサンゴを物理的に傷つけないようにしました。サンゴの稚魚は沈殿する基材に付着するため、人工ペプチド16 を使用して同様のプラスチック材料に沈殿させ、接着プロセスのための除去を容易にすることをお勧めします。ハンドリングストレスと呼吸反応への影響をさらに最小限に抑えるために、多くの成体のサンゴストレス実験で一般的であるように、結束バンドに取り付けられたサンゴを1〜2週間順応させることをお勧めします。ふたの斑点の上に生物を固定し、水の循環を可能にするために、他の変更が必要になる場合があります。もう1つの重要なトラブルシューティングステップは、特に酸素時系列の傾きで、速度を決定する必要がある信号検出です。結局のところ、これは、明らかに不安定なデータを除外するために適切な判断を下すことと、 respR 内の関数を組み合わせて、一貫して選択された領域からレートを抽出できるようにするか、データの線形領域を特定することによって自動的にレートを抽出できるようにすることに帰着します。これを行う方法のその他の例は、 respR の Web サイトで入手できます。
この方法は、呼吸の下限の測定を非常に小さく、固着した海洋無脊椎動物にまで拡張するために開発されました。明らかな制限は、このプロトコルは、より大きなバイオマス用に設計されたプロトコルと比較して、偽陽性が発生しやすい可能性があることです。しかし、これらの下限値を測定することが設計のポイントであったことを考えると、これは設計に織り込まれており、この手順をrespRパッケージとともに使用して、誤検出に対する保護を強化することができます。また、呼吸30を測定するための他のシステム、およびこれよりも少ない容量(~0.5〜1mL)の個々のカイアシ類31のスピロメトリーを含む小さな生物の測定のための他のシステムが存在するが、高価であるか、または特定の成分(攪拌能力)を欠いていることを認識することも重要である。ただし、このシステムはオープンソースであり、商用システム(コアマイクロプレートシステムなど)と比較して比較的低コストです。このシステムには、他のシステムにはない可能性のある攪拌などの重要な方法論的考慮事項も組み込まれています。内部攪拌棒機能は、多くの海洋生物(例えば、泳ぐカイアシ類)の自然な水の混合を再現するために不可欠ですが、これはしばしば不可能であり、データをほとんど使用できない可能性があります。対照的に、利用可能な他の混合方法には、追加の機器が必要で混合の成功が限られている巨大なロッカーベンチに呼吸計全体を置くこと、または生物に障害を引き起こす可能性のある振動による混合が含まれます。このため、サンゴの稚魚やその他の非常に小さな固着性生物にスピロメトリーを行うことができる唯一のシステムです。参考までに、ここに含まれた標本のサイズ範囲は、2.1〜3.6個のポリープ(わずか数ヶ月齢に相当)の範囲であり、最小から最大までの平均面積は1.3〜4.5mm2であった。
スピロメトリーは生態学研究の基本的な手段であり、この目的のために多くの方法が存在します。しかし、これらの既存の方法のほとんどは、魚全体、サンゴの破片、海草などの高バイオマスサンプルを対象としています32,33,34。この方法は、個々のサンゴの稚魚を使用した最初の方法です。さらに、この方法は、生物の機能に関する重要な生理学的情報を提供するため、多くの潜在的な用途があります。これは、ベースラインの健康推定値を特徴付け35、暑熱ストレス36などのサンゴの個体発生中の急性または長期ストレスの役割を理解し、またはサンゴ礁の健康を保護および改善するために管理者が設定できるしきい値を提供する37ことを目的とした研究にとって重要です。サンゴがホロビオントであり、共生生物群集がこの段階と生後1年間を通して比較的柔軟であることを考えると38、生物全体の機能を完全に文脈化するために、スピロメトリーデータと時間の経過に伴う群集の変化を組み合わせることは興味深いことです。重要なことは、この手法が「オープンサイエンス」技術に貢献し、オープンに共有、改善、標準化できるカスタム実験セットアップを作成するためのアウトラインを提供するのに役立つことです。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、Sam Noonan氏の支援とアドバイス、最初の回転測定チャンバーの使用についてSven Uthicke氏、エンジニアリングイラストレーションを担当のBen Shelab氏、および呼吸測定チャンバーのアダプターとホルダーの特注加工をしてくれたオーストラリア海洋科学研究所のワークショップに感謝します。サンゴは、AIMS G12 / 35236.1のグレートバリアリーフ海洋公園の許可の下で収集されました。珊瑚は倫理許可を必要としません。
Cost | |||
(1.1 – 1.6) Custom respirometry chambers | LabGlass Party Ldt. | 1.5 ml | $407.26 |
1.1 lids | AIMS workshop | Vial GL25 thread | ~$10 |
1.2 fiber-optics spots (FireStingO2 II fiberoptic optodes) | PyroScience | Oxygen sensor spots, 125 µm PET foil, Ø5 mm, with optical isolation, SN: 183801947 | $41.25 AUD each |
1.3 individual organism | NA | NA | NA |
1.4 flow-through stand | AIMS workshop | Custom | included in points 5 and 6 price (the workshop gave me an estimate of the lids, stand with gears, motor, incubation flow through |
1.5 magnetic stirrer | Any manufactuer is suitable | NA | ~$2? |
1.6 glass chamber (vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole, Labglass Pty Ltd, Stafford QLD) | Labglass Pty Ltd, Stafford QLD | Vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole | $50.9 AUD |
2 FireSting controller (2) | PyroSciences | NA | 4 sensors is 4000 Euros. 8 sensors used here. |
3 computer | NA | NA | NA |
4 heater/chiller | VWR International | NA | Small models around $4,000 AUD |
5 respirometry plate platform | AIMS workshop | 34 cm x 26 cm x 3 cm (although any dimensions are adequate to fit desired number of chambers) | $1250 AUD |
6 stirrer plate with gears (7) | AIMS workshop | 34 cm x 26 cm x 3 cm | $1250 AUD |
8 powered by the motor | AIMS workshop | Custom | $700 AUD |
9 power supply | Non-specific | NA | ~$300 AUD |
Aquarium glue | Seachem reef glue | 20g | $14 |
Oxygen Logger Software | PyroScience | NA | NA |
Polypipe and connectors | John Guest | NA | $20 |
Sodium Sulfite | Sigma | S0505-250G (CAS number 7757-83-7) | $54 |