Kontakttilstand Atomic Force mikroskopi som en hurtig teknik til morfologisk observation og bakteriel celleskadeanalyse

Summary

Her præsenterer vi anvendelsen af atomkraftmikroskopi (AFM) som en enkel og hurtig metode til bakteriel karakterisering og analyserer detaljer såsom bakteriestørrelse og form, bakteriekulturbiofilm og aktiviteten af nanopartikler som baktericider.

Abstract

Elektronmikroskopi er et af de værktøjer, der kræves for at karakterisere cellulære strukturer. Proceduren er imidlertid kompliceret og dyr på grund af prøveforberedelsen til observation. Atomkraftmikroskopi (AFM) er en meget nyttig karakteriseringsteknik på grund af dens høje opløsning i tre dimensioner og på grund af fraværet af ethvert krav til vakuum og prøveledningsevne. AFM kan afbilde en lang række prøver med forskellige topografier og forskellige typer materialer.

AFM giver 3D-topografiinformation i høj opløsning fra angstrom-niveau til mikronskala. I modsætning til traditionel mikroskopi bruger AFM en sonde til at generere et billede af overfladetopografien af en prøve. I denne protokol foreslås brugen af denne type mikroskopi til morfologisk og celleskadekarakterisering af bakterier fastgjort på en støtte. Stammer af Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) og Pseudomonas hunanensis (isoleret fra hvidløgsløgprøver) blev anvendt. I dette arbejde blev bakterieceller dyrket i specifikke kulturmedier. For at observere celleskader blev Staphylococcus aureus og Escherichia coli inkuberet med forskellige koncentrationer af nanopartikler (NP’er).

En dråbe bakteriel suspension blev fastgjort på en glasstøtte, og billeder blev taget med AFM i forskellige skalaer. De opnåede billeder viste bakteriens morfologiske egenskaber. Ved anvendelse af AFM var det endvidere muligt at observere skaden på den cellulære struktur forårsaget af effekten af NP’er. Baseret på de opnåede billeder kan kontakt-AFM bruges til at karakterisere morfologien af bakterieceller fastgjort på en understøtning. AFM er også et velegnet værktøj til undersøgelse af NP’ers virkninger på bakterier. Sammenlignet med elektronmikroskopi er AFM en billig og brugervenlig teknik.

Introduction

Forskellige bakterieformer blev først bemærket af Antony van Leeuwenhoek i det 17. århundrede¹. Bakterier har eksisteret i en stor mangfoldighed af former siden oldtiden, lige fra kugler til forgreningsceller². Celleform er en grundlæggende betingelse for bakterielle taxonomer til at beskrive og klassificere hver bakterieart, hovedsageligt til morfologisk adskillelse af gram-positiv og gram-negativ phyla³. Flere elementer er kendt for at bestemme bakterielle celleformer, som alle er involveret i celledækslerne og støtten som komponenter i cellevæggen og membranen såvel som i cytoskelettet. På denne måde belyser forskere stadig de kemiske, biokemiske og fysiske mekanismer og processer, der er involveret i bestemmelse af bakteriecelleformer, som alle er defineret af klynger af gener, der definerer bakterieformer ^2,4.

Derudover har forskere vist, at stavformen sandsynligvis er den forfædres form af bakterieceller, da denne celleform synes optimal i cellesignifikante parametre. Således betragtes kokker, spiral, vibrio, filamentøse og andre former som tilpasninger til forskellige miljøer; Faktisk har bestemte morfologier udviklet sig uafhængigt flere gange, hvilket tyder på, at bakteriernes former kunne være tilpasninger til bestemte miljøer ^3,5. Men i løbet af bakteriecellens livscyklus ændres celleformen, og dette sker også som en genetisk reaktion på skadelige miljøforhold³. Bakteriens celleform og størrelse bestemmer stærkt bakteriernes stivhed, robusthed og overflade-til-volumen-forhold, og denne egenskab kan udnyttes til bioteknologiske processer⁶.

Elektronisk mikroskopi bruges til at studere biologiske prøver på grund af den høje forstørrelse, der kan nås ud over lysbaserede mikroskoper. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) og scanningelektronmikroskopi (SEM) er de mest almindeligt anvendte teknikker til dette formål; Prøver kræver dog nogle behandlinger, før de placeres i mikroskopets kammer for at opnå passende billeder. Et gulddæksel på prøverne er påkrævet, og den tid, der bruges til total billedoptagelse, bør ikke være for lang. I modsætning hertil er atomkraftmikroskopi (AFM) en teknik, der i vid udstrækning anvendes til analyse af overflader, men anvendes også til undersøgelse af biologiske prøver.

Der er flere typer AFM-tilstande, der anvendes i overfladeanalyse, såsom kontakttilstand, berøringsfri tilstand eller tapping, magnetisk kraftmikroskopi (MFM), ledende AFM, piezoelektrisk kraftmikroskopi (PFM), peak force tapping (PFT), kontaktresonans og kraftvolumen. Hver tilstand bruges til analyse af materialer og giver forskellige oplysninger om materialernes overflade og deres mekaniske og fysiske egenskaber. Imidlertid anvendes nogle AFM-tilstande til analyse af biologiske prøver in vitro, såsom PFT, fordi PFT giver mulighed for at opnå topografiske og mekaniske data om celler i et flydende medium⁷.

I dette arbejde brugte vi den mest basale tilstand, der er inkluderet i enhver gammel og enkel AFM-model – kontakttilstanden. AFM bruger en skarp sonde (ca. <50 nm i diameter) til at scanne områder mindre end 100 μm. Sonden er justeret til prøven for at interagere med de kraftfelter, der er knyttet til prøven. Overfladen scannes med sonden for at holde kraften konstant. Derefter genereres et billede af overfladen ved at overvåge udkragningens bevægelse, når den bevæger sig over overfladen. De indsamlede oplysninger giver overfladens nanomekaniske egenskaber, såsom vedhæftning, elasticitet, viskositet og forskydning.

I AFM-kontakttilstand scannes udkragningen hen over prøven ved en fast afbøjning. Dette gør det muligt at bestemme højden af prøverne (Z), og dette repræsenterer en fordel i forhold til de andre elektroniske mikroskopteknikker. AFM-softwaren tillader generering af en 3D-billedscanning ved interaktionen mellem spidsen og prøveoverfladen, og spidsafbøjningen er korreleret med prøvens højde gennem en laser og en detektor.

I statisk tilstand (kontakttilstand) med konstant kraft præsenterer udgangen to forskellige billeder: højden (z-topografi) og afbøjnings- eller fejlsignalet. Statisk tilstand er en værdifuld, enkel billeddannelsestilstand, især for robuste prøver i luft, der kan håndtere de høje belastninger og vridningskræfter, der udøves af statisk tilstand. Afbøjnings- eller fejltilstanden betjenes i konstant krafttilstand. Topografibilledet forbedres dog yderligere ved at tilføje afbøjningssignalet til overfladestrukturen. I denne tilstand kaldes afbøjningssignalet også fejlsignalet, da afbøjningen er feedbackparameteren; Alle funktioner eller morfologi, der vises i denne kanal, skyldes “fejlen” i feedback-sløjfen eller rettere på grund af den feedback-sløjfe, der kræves for at opretholde et konstant afbøjningssætpunkt.

AFM’s unikke design gør den kompakt – lille nok til at passe på en bordplade – samtidig med at den har høj nok opløsning til at løse atomtrin. AFM-udstyret har lavere omkostninger end udstyret til andre elektroniske mikroskoper, og vedligeholdelsesomkostningerne er minimale. Mikroskopet kræver ikke et laboratorium med særlige forhold såsom et rent rum eller et isoleret rum; Det behøver kun et vibrationsfrit skrivebord. For AFM behøver prøverne ikke at gennemgå omfattende forberedelse som for andre teknikker (gulddæksel, slankning); Der må kun fastgøres en tør prøve til prøveholderen.

Vi bruger AFM-kontakttilstand til at observere bakterielle morfologier og virkningerne af NP’er. Populationen og cellulær morfologi af bakterier fastgjort på en støtte kan observeres, såvel som den cellulære skade produceret af nanopartikler på bakteriearterne. Billederne opnået ved AFM-kontakttilstand bekræfter, at det er et kraftfuldt værktøj og ikke er begrænset af reagenser og komplicerede procedurer, hvilket gør det til en enkel, hurtig og økonomisk metode til bakteriel karakterisering.

Protocol

1. Bakteriel isolering og identifikation Isolering af en endofytisk stamme fra hvidløgspæremeristemer:2 mm fragmenter af meristemer fra tidligere skrællede, desinficerede og skårne hvidløgsløg anbringes på trypticase sojaagar (TSA) som et rigt vækstmedium, og de inkuberes ved 25 °C i 1 dag. Baseret på de morfologiske forskelle i bakteriekolonierne – form, størrelse, farve, kant, transmitteret lys, reflekteret lys, tekstur, konsistens og pigmentproduktion – beskrive…

Representative Results

Billeder af morfologien og størrelsen af S. aureus og P. hunanensis stammer samt befolkningsorganisationen af begge stammer blev taget ved atomkraftmikroskopi i kontakttilstand.  S. aureus-billederne viste, at dens befolkning var fordelt på zoner med aggregater af kokker (figur 1A). Med en stigning i skala var der en større forståelse af populationsfordelingen og morfologien af kokkerne (figur 1B). Mikroskopirapporterne viste, at …

Discussion

Mikroskopi er en teknik, der almindeligvis anvendes i biologiske laboratorier, der muliggør undersøgelse af strukturen, størrelsen, morfologien og det cellulære arrangement af biologiske prøver. For at forbedre denne teknik kan der anvendes flere typer mikroskoper, der adskiller sig fra hinanden med hensyn til deres optiske eller elektroniske egenskaber, som bestemmer instrumentets opløsningseffekt.

I videnskabelig forskning kræves brugen af mikroskopi til karakterisering af bakteriecel…

Materials

AFM EasyScan 2	NanoSurf	discontinued	Measurement Media
bacteriological loop	No aplica	not applicable	instrument for bacterial inoculation
BigDye Terminator v3.1	ThermoFisher Scientific	4337455	Matrix installation kit
Bioedit	not applicable	version 7.2.5	Sequence alignment editor
Cary 60 spectrometer	Agilent Technologies	not applicable
ceftriazone	Merck	not applicable	antibiotic
centrifuge	eppendorf	not applicable	to remove particles that interfere with AFM
ContAI-G Silicon cantilever	BudgetSensors	ContAl-G-10	Measurement Media
eosin and methylene blue agar	Merck	not applicable	bacterial culture medium
Escherichia coli	American Type Culture Collection	ATCC 25922	bacterial strain
GoTaq Flexi DNA Polymerase	Promega	M8295	PCR of 16S rRNA gene
microplate	Thermo Scientific	10558295	for microdilution analysis
Müller-Hinton broth	Merck	not applicable	bacterial culture medium
nutrient agar	Merck	not applicable	bacterial culture medium
nutritious broth	Merck	not applicable	bacterial culture medium
Petri dishes	not applicable	not applicable	growth of bacteria
Pseudomonas hunanensis 9AP	not applicable	not applicable	isolated from the garlic bulb by CNRG
Sanger sequencing	Macrogen	not applicable	sequencing service
ScienceDesk Anti-Vibration workstation	ThorLabs
slides	not applicable	not applicable	glass holder for bacterial sample analysis
Staphylococcus aureus	American Type Culture Collection	ATCC 25923	bacterial strain
Thermalcycler	Applied Biosystems	Veriti-4375786	PCR amplification
Trypticasein soy agar	BD	BA-256665	growth media
ultrasonicator	Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC	not applicable	for mixing the nanoparticle dilutions