Modalità di contatto Microscopia a forza atomica come tecnica rapida per l'osservazione morfologica e l'analisi del danno cellulare batterico

Summary

Qui, presentiamo l’applicazione della microscopia a forza atomica (AFM) come metodo semplice e veloce per la caratterizzazione batterica e analizziamo dettagli come la dimensione e la forma batterica, i biofilm di coltura batterica e l’attività delle nanoparticelle come battericidi.

Abstract

La microscopia elettronica è uno degli strumenti necessari per caratterizzare le strutture cellulari. Tuttavia, la procedura è complicata e costosa a causa della preparazione del campione per l’osservazione. La microscopia a forza atomica (AFM) è una tecnica di caratterizzazione molto utile grazie alla sua alta risoluzione in tre dimensioni e all’assenza di qualsiasi requisito per il vuoto e la conduttività del campione. AFM può visualizzare un’ampia varietà di campioni con diverse topografie e diversi tipi di materiali.

AFM fornisce informazioni topografiche 3D ad alta risoluzione dal livello di angstrom alla scala dei micron. A differenza della microscopia tradizionale, AFM utilizza una sonda per generare un’immagine della topografia superficiale di un campione. In questo protocollo, l’uso di questo tipo di microscopia è suggerito per la caratterizzazione morfologica e del danno cellulare di batteri fissati su un supporto. Sono stati utilizzati ceppi di Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) e Pseudomonas hunanensis (isolati da campioni di bulbo d’aglio). In questo lavoro, le cellule batteriche sono state coltivate in specifici terreni di coltura. Per osservare il danno cellulare, Staphylococcus aureus ed Escherichia coli sono stati incubati con diverse concentrazioni di nanoparticelle (NP).

Una goccia di sospensione batterica è stata fissata su un supporto di vetro e le immagini sono state scattate con AFM a diverse scale. Le immagini ottenute hanno mostrato le caratteristiche morfologiche dei batteri. Inoltre, utilizzando l’AFM, è stato possibile osservare il danno alla struttura cellulare causato dall’effetto delle NP. Sulla base delle immagini ottenute, l’AFM a contatto può essere utilizzato per caratterizzare la morfologia delle cellule batteriche fissate su un supporto. L’AFM è anche uno strumento adatto per lo studio degli effetti delle NP sui batteri. Rispetto alla microscopia elettronica, l’AFM è una tecnica economica e facile da usare.

Introduction

Diverse forme batteriche sono state notate per la prima volta da Antony van Leeuwenhoek nel 17 ° secolo¹. I batteri sono esistiti in una grande diversità di forme fin dai tempi antichi, che vanno dalle sfere alle cellule ramificate². La forma cellulare è una condizione fondamentale per i tassonomisti batterici per descrivere e classificare ogni specie batterica, principalmente per la separazione morfologica dei phyla gram-positivi e gram-negativi³. Diversi elementi sono noti per determinare le forme cellulari batteriche, che sono tutti coinvolti nelle coperture cellulari e nel supporto come componenti della parete cellulare e della membrana, nonché nel citoscheletro. In questo modo, gli scienziati stanno ancora chiarendo i meccanismi e i processi chimici, biochimici e fisici implicati nella determinazione delle forme cellulari batteriche, che sono tutti definiti da gruppi di geni che definiscono le forme batteriche ^2,4.

Inoltre, gli scienziati hanno dimostrato che la forma dell’asta è probabilmente la forma ancestrale delle cellule batteriche, poiché questa forma cellulare appare ottimale nei parametri significativi delle cellule. Pertanto, cocchi, spirale, vibrione, filamentoso e altre forme sono considerati adattamenti a vari ambienti; Infatti, particolari morfologie si sono evolute indipendentemente più volte, suggerendo che le forme dei batteri potrebbero essere adattamenti a particolari ambienti ^3,5. Tuttavia, durante tutto il ciclo di vita delle cellule batteriche, la forma della cellula cambia, e questo si verifica anche come risposta genetica a condizioni ambientali dannose³. La forma e le dimensioni delle cellule batteriche determinano fortemente la rigidità, la robustezza e il rapporto superficie-volume dei batteri, e questa caratteristica può essere sfruttata per processi biotecnologici⁶.

La microscopia elettronica viene utilizzata per studiare campioni biologici a causa dell’elevato ingrandimento che può essere raggiunto oltre i microscopi basati sulla luce. La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e la microscopia elettronica a scansione (SEM) sono le tecniche più comunemente utilizzate per questo scopo; Tuttavia, i campioni richiedono alcuni trattamenti prima di essere inseriti nella camera del microscopio al fine di ottenere immagini appropriate. È necessaria una copertina dorata sui campioni e il tempo utilizzato per l’acquisizione totale dell’immagine non dovrebbe essere troppo lungo. Al contrario, la microscopia a forza atomica (AFM) è una tecnica ampiamente utilizzata nell’analisi delle superfici, ma è anche impiegata nello studio di campioni biologici.

Esistono diversi tipi di modalità AFM utilizzate nell’analisi delle superfici, come la modalità di contatto, la modalità senza contatto o la maschiatura, la microscopia a forza magnetica (MFM), l’AFM conduttivo, la microscopia a forza piezoelettrica (PFM), la maschiatura della forza di picco (PFT), la risonanza di contatto e il volume della forza. Ogni modalità viene utilizzata nell’analisi dei materiali e fornisce informazioni diverse sulla superficie dei materiali e sulle loro proprietà meccaniche e fisiche. Tuttavia, alcune modalità AFM sono utilizzate per l’analisi di campioni biologici in vitro, come PFT, perché PFT consente di ottenere dati topografici e meccanici su cellule in un mezzo liquido⁷.

In questo lavoro, abbiamo utilizzato la modalità più semplice inclusa in ogni vecchio e semplice modello AFM: la modalità di contatto. AFM utilizza una sonda affilata (circa <50 nm di diametro) per scansionare aree inferiori a 100 μm. La sonda è allineata al campione per interagire con i campi di forza associati al campione. La superficie viene scansionata con la sonda per mantenere costante la forza. Quindi, viene generata un'immagine della superficie monitorando il movimento del cantilever mentre si muove sulla superficie. Le informazioni raccolte forniscono le proprietà nano-meccaniche della superficie, come l'adesione, l'elasticità, la viscosità e il taglio.

Nella modalità di contatto AFM, il cantilever viene scansionato attraverso il campione con una deflessione fissa. Ciò consente di determinare l’altezza dei campioni (Z), e questo rappresenta un vantaggio rispetto alle altre tecniche di microscopio elettronico. Il software AFM consente la generazione di una scansione di immagini 3D mediante l’interazione tra la punta e la superficie del campione e la deflessione della punta è correlata all’altezza del campione attraverso un laser e un rivelatore.

In modalità statica (modalità contatto) con forza costante, l’uscita presenta due immagini diverse: l’altezza (topografia z) e il segnale di deflessione o errore. La modalità statica è una modalità di imaging preziosa e semplice, in particolare per campioni robusti in aria in grado di gestire gli elevati carichi e le forze torsionali esercitate dalla modalità statica. La modalità di deflessione o errore viene azionata in modalità forza costante. Tuttavia, l’immagine topografica viene ulteriormente migliorata aggiungendo il segnale di deflessione alla struttura della superficie. In questa modalità, il segnale di deflessione viene anche definito segnale di errore poiché la deflessione è il parametro di feedback; Qualsiasi caratteristica o morfologia che appare in questo canale è dovuta all'”errore” nel ciclo di feedback o, meglio, al ciclo di feedback richiesto per mantenere un setpoint di deflessione costante.

Il design unico di AFM lo rende compatto – abbastanza piccolo da stare su un tavolo – pur avendo una risoluzione abbastanza alta per risolvere i passaggi atomici. L’apparecchiatura AFM ha un costo inferiore rispetto alle apparecchiature per altri microscopi elettronici e i costi di manutenzione sono minimi. Il microscopio non richiede un laboratorio con condizioni particolari come una camera bianca o uno spazio isolato; Ha solo bisogno di una scrivania priva di vibrazioni. Per l’AFM, i campioni non devono essere sottoposti a una preparazione elaborata come per altre tecniche (copertura dorata, dimagrimento); Solo un campione secco deve essere attaccato al portacampioni.

Utilizziamo la modalità di contatto AFM per osservare le morfologie batteriche e gli effetti delle NP. Si può osservare la popolazione e la morfologia cellulare dei batteri fissati su un supporto, così come il danno cellulare prodotto dalle nanoparticelle sulle specie batteriche. Le immagini ottenute dalla modalità di contatto AFM confermano che si tratta di uno strumento potente e non limitato da reagenti e procedure complicate, rendendolo un metodo semplice, veloce ed economico per la caratterizzazione batterica.

Protocol

1. Isolamento batterico e identificazione Isolamento di un ceppo endofitico dai meristemi del bulbo d’aglio:Posizionare frammenti di meristemi di 2 mm provenienti da bulbi d’aglio precedentemente sbucciati, disinfettati e tagliati su agar di soia tripticasi (TSA) come mezzo di crescita ricco e incubare a 25 °C per 1 giorno. Sulla base delle differenze morfologiche delle colonie batteriche – forma, dimensione, colore, bordo, luce trasmessa, luce riflessa, consistenza, consist…

Representative Results

Le immagini della morfologia e delle dimensioni dei ceppi di S. aureus e P. hunanensis , così come l’organizzazione della popolazione di entrambi i ceppi, sono state prese mediante microscopia a forza atomica in modalità contatto. Le immagini di S. aureus hanno mostrato che la sua popolazione era distribuita per zone con aggregati di cocchi (Figura 1A). Con l’aumento della scala, c’è stato un maggiore apprezzamento della distribuzione della popolazione e della …

Discussion

La microscopia è una tecnica comunemente usata nei laboratori biologici che consente di studiare la struttura, le dimensioni, la morfologia e la disposizione cellulare dei campioni biologici. Per migliorare questa tecnica, possono essere utilizzati diversi tipi di microscopi che differiscono tra loro in termini di caratteristiche ottiche o elettroniche, che determinano la potenza di risoluzione dello strumento.

Nella ricerca scientifica, l’uso della microscopia è richiesto per la caratterizz…

Materials

AFM EasyScan 2	NanoSurf	discontinued	Measurement Media
bacteriological loop	No aplica	not applicable	instrument for bacterial inoculation
BigDye Terminator v3.1	ThermoFisher Scientific	4337455	Matrix installation kit
Bioedit	not applicable	version 7.2.5	Sequence alignment editor
Cary 60 spectrometer	Agilent Technologies	not applicable
ceftriazone	Merck	not applicable	antibiotic
centrifuge	eppendorf	not applicable	to remove particles that interfere with AFM
ContAI-G Silicon cantilever	BudgetSensors	ContAl-G-10	Measurement Media
eosin and methylene blue agar	Merck	not applicable	bacterial culture medium
Escherichia coli	American Type Culture Collection	ATCC 25922	bacterial strain
GoTaq Flexi DNA Polymerase	Promega	M8295	PCR of 16S rRNA gene
microplate	Thermo Scientific	10558295	for microdilution analysis
Müller-Hinton broth	Merck	not applicable	bacterial culture medium
nutrient agar	Merck	not applicable	bacterial culture medium
nutritious broth	Merck	not applicable	bacterial culture medium
Petri dishes	not applicable	not applicable	growth of bacteria
Pseudomonas hunanensis 9AP	not applicable	not applicable	isolated from the garlic bulb by CNRG
Sanger sequencing	Macrogen	not applicable	sequencing service
ScienceDesk Anti-Vibration workstation	ThorLabs
slides	not applicable	not applicable	glass holder for bacterial sample analysis
Staphylococcus aureus	American Type Culture Collection	ATCC 25923	bacterial strain
Thermalcycler	Applied Biosystems	Veriti-4375786	PCR amplification
Trypticasein soy agar	BD	BA-256665	growth media
ultrasonicator	Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC	not applicable	for mixing the nanoparticle dilutions