רומן in vivo טכניקות הדמיה טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת להערכת ההתקדמות של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי

Summary

באמצעות מודל עכבר של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD) הנגרמת על ידי דיאטה, אנו מתארים את השימוש בטכניקות הדמיה מיקרו-ממוחשבות חדשניות in vivo כשיטה לא פולשנית להערכת שלבי ההתקדמות של NAFLD, תוך התמקדות בעיקר ברשת כלי הדם בכבד בשל מעורבותה המשמעותית בחוסר ויסות כבד הקשור ל- NAFLD.

Abstract

מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD) היא בעיה בריאותית עולמית הולכת וגדלה, וההשפעה של NAFLD מורכבת על ידי היעדר טיפולים יעילים כיום. גורמים מגבילים ניכרים המעכבים אבחון מדויק ועדכני (כולל דירוג) וניטור של NAFLD, כמו גם פיתוח טיפולים פוטנציאליים, הם הליקויים הנוכחיים באפיון מבנה המיקרו-סביבה בכבד ובניקוד שלב המחלה באופן מרחבי-זמני ולא פולשני. באמצעות מודל עכבר NAFLD המושרה על ידי דיאטה, חקרנו את השימוש בטכניקות הדמיה של טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת in vivo (CT) כשיטה לא פולשנית להערכת שלבי ההתקדמות של NAFLD, תוך התמקדות בעיקר ברשת כלי הדם בכבד בשל מעורבותה המשמעותית בחוסר ויסות בכבד הקשור ל- NAFLD. מתודולוגיית הדמיה זו מאפשרת ניתוח אורך של סטאטוזיס בכבד וספיגת רקמות תפקודיות, כמו גם הערכה של נפח הדם היחסי, קוטר הווריד הפורטלי וצפיפות רשת כלי הדם. הבנת ההתאמות של רשת כלי הדם בכבד במהלך התקדמות NAFLD וקורלציה זו עם דרכים אחרות לאפיון התקדמות המחלה (סטאטוזיס, דלקת, פיברוזיס) באמצעות השיטה המוצעת יכולה לסלול את הדרך לקראת הקמת גישות חדשות, יעילות יותר וניתנות לשחזור לחקר NAFLD בעכברים. פרוטוקול זה צפוי גם לשדרג את ערכם של מודלים פרה-קליניים בבעלי חיים לחקר פיתוח טיפולים חדשניים נגד התקדמות המחלה.

Introduction

מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD) היא מחלה מטבולית המשפיעה על כ -25% מהאוכלוסייה ו ->80% מהאנשים הסובלים מהשמנת יתר חולנית¹. על פי הערכות, שליש מהאנשים הללו מתקדמים לסטאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH), המאופיינת בסטאטוזיס כבד, דלקת ופיברוזיס². NASH הוא שלב מחלה עם סיכון גבוה משמעותית להתפתחות שחמת הכבד וקרצינומה הפטוצלולרית (HCC)^3,4. מסיבה זו, NASH הוא כיום הגורם השני בשכיחותו להשתלת כבד, והוא גם צפוי להפוך בקרוב למנבא החשוב ביותר להשתלת כבד ^5,6,7. למרות שכיחותו וחומרתו, אין טיפול ספציפי למחלה זמין עבור NAFLD, והטיפולים הקיימים נועדו רק להתמודד עם פתולוגיות הקשורות למחלה כגון עמידות לאינסולין והיפרליפידמיה ^5,6.

בשנים האחרונות, התפקיד הפתופיזיולוגי וההתאמות של האנדותל, ובכלל, של רשת כלי הדם של רקמות מטבוליות, כגון רקמת השומן והכבד, צוברים חשיבות רבה יותר במחקר, במיוחד במהלך השמנת יתר וחוסר ויסות מטבולי ^7,8. האנדותל הוא חד-שכבה תאית המרפדת את רשת כלי הדם באופן פנימי, ופועלת כמחסום תפקודי ומבני. הוא גם תורם לתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים, כגון פקקת, הובלת מטבוליטים, דלקת ואנגיוגנזה ^9,10. במקרה של הכבד, רשת כלי הדם מאופיינת בין היתר בנוכחות של תאים מיוחדים מאוד, המוגדרים כתאי אנדותל סינוסואידים בכבד (LSECs). תאים אלה חסרים קרום מרתף ויש להם fenestrae מרובים, המאפשר העברה קלה יותר של מצעים בין הדם ואת parenchyma הכבד. בשל מיקומם האנטומי הייחודי ומאפייניהם, סביר להניח של-LSECs יש תפקיד מכריע בתהליכים הפתופיזיולוגיים של הכבד, כולל התפתחות דלקת כבד ופיברוזיס במהלך NAFLD/NASH. ואכן, ההתאמות הפתולוגיות, המולקולריות והתאיות שעוברות LSECs במהלך NAFLD תורמות להתקדמות המחלה¹¹. באופן ספציפי, אנגיוגנזה בכבד תלוית LSEC המתרחשת במהלך NAFLD קשורה באופן משמעותי עם התפתחות דלקת והתקדמות המחלה ל- NASH או אפילו HCC¹². חוץ מזה, NAFLD מוקדם הקשור להשמנת יתר מאופיין בהתפתחות עמידות לאינסולין ב- LSECs, אשר מקדימה את התפתחות דלקת הכבד או סימני NAFLD מתקדמים אחרים¹³.

בנוסף, LSECs התגלו לאחרונה כרגולטורים מרכזיים של זרימת הדם בכבד והתאמות רשת כלי הדם במהלך מחלת כבד של מספר אטיולוגיות^14,15. ואכן, מחלת כבד כרונית מאופיינת בהתכווצות כלי דם תוך כבדית בולטת ובהתנגדות מוגברת לזרימת הדם, התורמות להתפתחות יתר לחץ דם פורטלי¹⁶. במקרה של NAFLD, מספר מנגנונים הקשורים ל-LSEC תורמים לתופעה זו. לדוגמה, תנגודת לאינסולין ספציפית ל-LSEC, כפי שהוזכר לעיל, קשורה להרחבת כלי דם מופחתת תלוית אינסולין של כלי הדם בכבד¹³. חוץ מזה, במהלך המחלה, כלי הדם בכבד הופך רגיש יותר vasoconstrictors, תורם עוד יותר לפגיעה בזרימת הדם בכבד ומוביל את הופעתה של מתח גזירה, אשר שניהם לגרום לשיבוש של microcirculation סינוסואידלי¹⁷. עובדות אלה מצביעות על כך שכלי הדם הם יעד מרכזי במחלות כבד. עם זאת, גורמים מגבילים המעכבים את האבחון והניטור בזמן של NAFLD/NASH, כמו גם את הפיתוח של טיפולים פוטנציאליים, הם הליקויים באפיון עקבי של מיקרו-סביבה בכבד ומבנה (מיקרו) כלי דם, כמו גם הניקוד של שלב המחלה באופן מרחבי-זמני ולא פולשני.

הדמיית טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (CT) היא כיום שיטת ההדמיה הלא פולשנית הסטנדרטית לתיאור מדויק של מידע אנטומי בתוך אורגניזם חי. מיקרו-CT ו-MRI מייצגים שתי שיטות הדמיה משלימות שיכולות לכסות מגוון רחב של פתולוגיות ולספק רזולוציה ופירוט יוצאי דופן במבנים וברקמות המודמיים. מיקרו-CT, בפרט, הוא כלי מהיר ומדויק מאוד המשמש לעתים קרובות לחקר פתולוגיות כגון מחלות עצם ושינויים הקשורים לפני השטח של העצם¹⁸, הערכת התקדמות פיברוזיס ריאתי לאורך זמן¹⁹, אבחון סרטן ריאות והיערכות²⁰, או אפילו בחינת פתולוגיות שיניים²¹, ללא כל הכנה מיוחדת (או הרס) של הדגימות להיות דמות.

טכנולוגיית ההדמיה של מיקרו-CT מבוססת על תכונות ההנחתה השונות של איברים שונים מבחינת האינטראקציה של קרני רנטגן עם חומר. איברים המציגים הבדלי הנחתה גבוהים בקרני רנטגן מתוארים בניגודיות גבוהה בתמונות CT (כלומר, הריאות נראות כהות והעצמות בהירות). איברים בעלי תכונות הנחתה דומות מאוד (רקמות רכות שונות), מאתגרים להבחנה בתמונות CT²². כדי להתמודד עם מגבלה זו, חומרי ניגוד מיוחדים המבוססים על יוד, זהב וביסמוט נחקרו בהרחבה לשימוש in vivo . חומרים אלה משנים את תכונות ההנחתה של הרקמות שבהן הם מצטברים, מנוקים לאט ממחזור הדם, ומאפשרים אופסיפיקציה אחידה ויציבה של מערכת כלי הדם כולה או רקמות נבחרות²³.

באבחון אנושי, הדמיית CT וטכניקות דומות, כגון מקטע שומן צפיפות פרוטונים הנגזר מ- MRI, כבר נמצאות בשימוש לקביעת תכולת שומן בכבד^24,25. בהקשר של NAFLD, ניגודיות גבוהה של רקמות רכות חיונית להבחנה מדויקת בין נגעים פתולוגיים או כלי דם קטנים. למטרה זו נעשה שימוש בחומרי ניגוד המספקים ניגודיות משופרת של מאפייני רקמת הכבד. כלים וחומרים כאלה מאפשרים לחקור מאפייני כבד מרובים וביטויים פתולוגיים אפשריים, כגון ארכיטקטורה וצפיפות של רשת כלי הדם, שקיעת שומנים/סטאטוזיס וספיגת רקמה תפקודית/העברת שומנים (כילומיקרון) בכבד. בנוסף, ניתן להעריך גם את נפח הדם היחסי בכבד ואת קוטר הווריד הפורטלי. בזמן סריקה קצר מאוד, כל הפרמטרים הללו מספקים מידע שונה ומשלים על הערכה והתקדמות של NAFLD, אשר יכול לשמש לפיתוח אבחנה לא פולשנית ומפורטת.

במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול שלב אחר שלב לשימוש בטכניקות הדמיה מיקרו-CT חדשניות in vivo כשיטה לא פולשנית להערכת שלבי ההתקדמות של NAFLD. באמצעות פרוטוקול זה, ניתוח אורך של סטאטוזיס בכבד וספיגת רקמות תפקודיות, כמו גם הערכה של נפח הדם היחסי, קוטר הווריד הפורטלי וצפיפות רשת כלי הדם, ניתן לבצע וליישם במודלים עכבריים של מחלת כבד.

Protocol

כל ההליכים בוצעו על ידי אנשי ביומטק בהתאם לתקנות הרווחה האירופיות והלאומיות ואושרו על ידי הרשויות הלאומיות (מספר רישיון: EL 25, BIOexp 45/PN 49553, 21/01/20). כל הניסויים תוכננו ודווחו בהתאם להנחיות ARRIVE26. העכברים נרכשו ממכון פסטר ההלני, אתונה, יוון. הערה: בעלי החיים שוכנו בקבוצ…

Representative Results

במחקר מייצג זה, הדמיית מיקרו-CT ללא כל חומר ניגוד הצביעה על אחוז גבוה יותר של שומן בכבד בעכברים עם NAFLD בהשוואה לבקרות (טבלה 2), ואישרה את הפתולוגיה. באמצעות חומר הניגוד ExiTron וארכיטקטורת רשת כלי הדם בכבד וניתוח הצפיפות שתוארו לעיל, צפיפות הנפח הכוללת של רשת כלי הדם בכבד נמצאה גבוהה יות?…

Discussion

השיטה המומלצת כיום לאבחון והיערכות NAFLD בבני אדם היא ביופסיית כבד, הטומנת בחובה סיכון לדימום מורכב, כמו גם לאי דיוקי דגימה⁴⁰. להיפך, במודלים של בעלי חיים, אבחון כזה מבוצע על ידי היסטולוגיה לאחר המוות, אם כי פרוטוקולים לביופסיה של כבד שרידות זמינים כיום ומומלצים כאשר תכנון המחקר מ…

Materials

eXIA160	Binitio Biomedical, Inc.		https://www.binitio.com/?Page=Products
High fat diet with 60% of kilocalories from fat	Research Diets, New Brunswick, NJ, USA	D12492
High-fructose corn syrup	Best flavors, CA	hfcs-1gallon
Lacrinorm ophthalmic ointment	Bausch & Lomb
Normal diet with 10% of kilocalories from fat	Research Diets, New Brunswick, NJ, USA	D12450
Viscover ExiTron nano 12000	Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-095-698
VivoQuant	Invicro
X-CUBE	Molecubes, Belgium		https://www.molecubes.com/systems/