Novas Técnicas de Imagem por Microtomografia Computadorizada In Vivo para Avaliação da Progressão da Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica

Summary

Usando um modelo de camundongo com doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) induzida por dieta, descrevemos o uso de novas técnicas de microtomografia computadorizada in vivo como um método não invasivo para avaliar os estágios de progressão da DHGNA, enfocando predominantemente a rede vascular hepática devido ao seu envolvimento significativo na desregulação hepática relacionada à DHGNA.

Abstract

A doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) é um crescente problema de saúde global, e o impacto da DHGNA é agravado pela atual falta de tratamentos eficazes. Consideráveis fatores limitantes que dificultam o diagnóstico oportuno e preciso (incluindo a graduação) e o monitoramento da DHGNA, bem como o desenvolvimento de potenciais terapias, são as atuais inadequações na caracterização da estrutura do microambiente hepático e na pontuação do estágio da doença de forma espaço-temporal e não invasiva. Usando um modelo de camundongo com DHGNA induzida por dieta, investigamos o uso de técnicas de imagem de microtomografia computadorizada (TC) in vivo como um método não invasivo para avaliar os estágios de progressão da DHGNA, enfocando predominantemente a rede vascular hepática devido ao seu envolvimento significativo na desregulação hepática relacionada à DHGNA. Essa metodologia de imagem permite a análise longitudinal da esteatose hepática e da captação tecidual funcional, bem como a avaliação do volume sanguíneo relativo, do diâmetro da veia porta e da densidade da rede vascular. Compreender as adaptações da rede vascular hepática durante a progressão da DHGNA e correlacioná-la com outras formas de caracterizar a progressão da doença (esteatose, inflamação, fibrose) usando o método proposto pode abrir caminho para o estabelecimento de novas abordagens, mais eficientes e reprodutíveis para a pesquisa da DHGNA em camundongos. Espera-se também que este protocolo atualize o valor dos modelos animais pré-clínicos para investigar o desenvolvimento de novas terapias contra a progressão da doença.

Introduction

A doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) é uma doença metabólica que afeta aproximadamente 25% da população e >80% das pessoas obesas mórbidas¹. Estima-se que um terço desses indivíduos evolua para esteato-hepatite não alcoólica (EHNA), que se caracteriza por esteatose hepática, inflamação e fibrose2^. A EHNA é um estágio da doença com risco significativamente maior para o desenvolvimento de cirrose e carcinoma hepatocelular (CHC)^3,4. Por essa razão, a EHNA é atualmente a segunda causa mais comum de transplante hepático, e espera-se que em breve se torne o mais importante preditor de transplante hepático ^5,6,7. Apesar de sua prevalência e gravidade, nenhuma terapia doença-específica está disponível para a DHGNA, e os tratamentos existentes visam apenas combater patologias associadas à doença, como resistência insulínica e hiperlipidemia ^5,6.

Nos últimos anos, o papel fisiopatológico e as adaptações do endotélio e, em geral, da rede vascular de tecidos metabólicos, como o tecido adiposo e o fígado, vêm ganhando maior importância nas pesquisas, principalmente durante a obesidade e a desregulação^{metabólica7,8}. O endotélio é uma monocamada celular que reveste internamente a rede vascular, atuando como barreira funcional e estrutural. Também contribui para vários processos fisiológicos e patológicos, como trombose, transporte de metabólitos, inflamação e angiogênese ^9,10. No caso do fígado, a rede vascular caracteriza-se, entre outras características, pela presença de células altamente especializadas, definidas como células endoteliais sinusoidais hepáticas (LSECs). Essas células não possuem membrana basal e possuem múltiplas fenestras, permitindo a transferência mais fácil de substratos entre o parênquima sanguíneo e hepático. Devido à sua localização anatômica e características distintas, os LSECs provavelmente têm um papel crucial nos processos fisiopatológicos do fígado, incluindo o desenvolvimento de inflamação e fibrose hepática durante a DHGNA/EHNA. De fato, as adaptações patológicas, moleculares e celulares que os LSECs sofrem no curso da DHGNA contribuem para a progressão da doença¹¹. Especificamente, a angiogênese hepática dependente de LSEC que ocorre durante a DHGNA está significativamente associada ao desenvolvimento de inflamação e à progressão da doença para EHNA ou mesmo CHC¹². Além disso, a DHGNA precoce relacionada à obesidade é caracterizada pelo desenvolvimento de resistência insulínica nos LSECs, que precede o desenvolvimento de inflamação hepática ou outros sinais avançados de DHGNA¹³.

Além disso, os LSECs emergiram recentemente como reguladores centrais do fluxo sanguíneo hepático e adaptações da rede vascular durante doenças hepáticas de diversas etiologias^14,15. De fato, a doença hepática crônica é caracterizada por proeminente vasoconstrição intra-hepática e aumento da resistência ao fluxo sanguíneo, que contribuem para o desenvolvimento da hipertensão portal¹⁶. No caso da DHGNA, vários mecanismos relacionados à LSEC contribuem para esse fenômeno. Por exemplo, a resistência insulínica específica para LSC, como mencionado acima, está associada à redução da vasodilatação insulino-dependente da vasculatura hepática¹³. Além disso, com o curso da doença, a vasculatura hepática torna-se mais sensível aos vasoconstritores, contribuindo ainda mais para o comprometimento do fluxo sanguíneo hepático e levando ao surgimento de estresse de cisalhamento, que resultam em ruptura da microcirculação sinusoidal¹⁷. Esses fatos sugerem que a vasculatura é um alvo chave na doença hepática. No entanto, fatores limitantes que dificultam o diagnóstico e o monitoramento oportunos da DHGNA/EHNA, bem como o desenvolvimento de potenciais terapias, são as inadequações na caracterização consistente do microambiente hepático e da estrutura (micro)vascular, bem como a pontuação do estágio da doença de forma espaço-temporal e não invasiva.

A microtomografia computadorizada (TC) é atualmente o método de imagem não invasivo padrão-ouro para retratar com precisão informações anatômicas dentro de um organismo vivo. A micro-TC e a RM representam dois métodos de imagem complementares que podem cobrir uma vasta gama de patologias e fornecer resolução e detalhes excepcionais nas estruturas e tecidos imageados. A micro-TC, em particular, é uma ferramenta muito rápida e precisa, sendo frequentemente utilizada para estudar patologias como doenças ósseas e alterações da superfície óssea associadas18, avaliar a progressão da fibrose pulmonar ao longo do^tempo19, diagnosticar câncer de pulmão e seu^{estadiamento20}, ou mesmo examinar patologias^dentárias21, sem qualquer preparo especial (ou destruição) das amostras que estão sendo analisadas.

A tecnologia de imagem da micro-TC baseia-se nas diferentes propriedades de atenuação de vários órgãos em termos de interação dos raios X com a matéria. Órgãos com altas diferenças de atenuação radiográfica são representados com alto contraste nas imagens de TC (ou seja, os pulmões parecem escuros e os ossos claros). Órgãos com propriedades atenuantes muito semelhantes (diferentes tecidos moles) são difíceis de distinguir nas imagens de TC²². Para resolver essa limitação, agentes de contraste especializados à base de iodo, ouro e bismuto têm sido extensivamente investigados para uso in vivo . Esses agentes alteram as propriedades atenuantes dos tecidos nos quais se acumulam, são eliminados lentamente da circulação e permitem a opacificação uniforme e estável de todo o sistema vascular ou tecidos^{escolhidos 23}.

No diagnóstico humano, a TC e técnicas comparáveis, como a fração gorda de densidade de prótons derivada da RM, já são utilizadas para a determinação do conteúdo de gordura hepática^24,25. No contexto da DHGNA, o alto contraste de partes moles é essencial para distinguir com precisão lesões patológicas ou pequenos vasos. Para isso, são utilizados agentes de contraste que proporcionam maior contraste nas características do tecido hepático. Tais ferramentas e materiais permitem o estudo de múltiplas características hepáticas e possíveis expressões patológicas, tais como a arquitetura e densidade da rede vascular, deposição/esteatose lipídica e captação tecidual funcional/transferência de lipídios (quilomícrons) no fígado. Além disso, o volume sanguíneo relativo hepático e o diâmetro da veia porta também podem ser avaliados. Em um tempo de exame muito curto, todos esses parâmetros fornecem informações diferentes e complementares sobre a avaliação e a progressão da DHGNA, que podem ser usadas para desenvolver um diagnóstico não invasivo e detalhado.

Neste artigo, apresentamos um protocolo passo a passo para o uso de novas técnicas de imagem por micro-TC in vivo como um método não invasivo para avaliar os estágios de progressão da DHGNA. Por meio desse protocolo, a análise longitudinal da esteatose hepática e da captação tecidual funcional, bem como a avaliação do volume sanguíneo relativo, diâmetro da veia porta e densidade da rede vascular, podem ser realizadas e aplicadas em modelos murinos de hepatopatia.

Protocol

Todos os procedimentos foram realizados pelo pessoal da BIOEMTECH de acordo com os regulamentos de bem-estar europeus e nacionais e foram aprovados pelas autoridades nacionais (número de licença EL 25 BIOexp 45/PN 49553 21/01/20). Todos os experimentos foram delineados e relatados com aderência às diretrizes do ARRIVE26. Os ratos foram comprados do Instituto Helênico Pasteur, Atenas, Grécia. OBS: Os animais foram alojados em gaiolas ventiladas individualmente enri…

Representative Results

Neste estudo representativo, a micro-TC sem contraste indicou maior percentual de gordura hepática em camundongos com DHGNA em relação aos controles (Tabela 2), confirmando a patologia. Usando o contraste ExiTron e a análise da arquitetura e densidade da rede vascular hepática descrita acima, a densidade de volume total da rede vascular hepática foi maior em camundongos com DHGNA em comparação com controles saudáveis (Figura 6, Tabela 2). Camundongo…

Discussion

O método atualmente recomendado para o diagnóstico e estadiamento da DHGNA em humanos é a biópsia hepática, que abriga o risco de complexidades hemorrágicas, bem como imprecisões de^amostragem40. Ao contrário, em modelos animais, esse diagnóstico é realizado por histologia post-mortem, embora protocolos para biópsia hepática de sobrevivência já estejam disponíveis e sejam recomendados quando o desenho do estudo^permitir41. O uso da histologia post-mortem signif…

Materials

eXIA160	Binitio Biomedical, Inc.		https://www.binitio.com/?Page=Products
High fat diet with 60% of kilocalories from fat	Research Diets, New Brunswick, NJ, USA	D12492
High-fructose corn syrup	Best flavors, CA	hfcs-1gallon
Lacrinorm ophthalmic ointment	Bausch & Lomb
Normal diet with 10% of kilocalories from fat	Research Diets, New Brunswick, NJ, USA	D12450
Viscover ExiTron nano 12000	Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-095-698
VivoQuant	Invicro
X-CUBE	Molecubes, Belgium		https://www.molecubes.com/systems/