Nuevas técnicas de imagen de microtomografía computarizada in vivo para evaluar la progresión de la enfermedad del hígado graso no alcohólico
Summary
Utilizando un modelo de ratón de enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) inducida por la dieta, describimos el uso de nuevas técnicas de imagen de microtomografía computarizada in vivo como método no invasivo para evaluar las etapas de progresión de la EHGNA, centrándonos predominantemente en la red vascular hepática debido a su participación significativa en la desregulación hepática relacionada con la EHGNA.
Abstract
La enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) es un problema de salud mundial creciente, y el impacto de la EHGNA se ve agravado por la falta actual de tratamientos eficaces. Los factores limitantes considerables que dificultan el diagnóstico oportuno y preciso (incluida la clasificación) y el seguimiento de la EHGNA, así como el desarrollo de posibles terapias, son las insuficiencias actuales en la caracterización de la estructura del microambiente hepático y la puntuación del estadio de la enfermedad de manera espaciotemporal y no invasiva. Utilizando un modelo de ratón de EHGNA inducido por la dieta, investigamos el uso de técnicas de imagen de microtomografía computarizada (TC) in vivo como método no invasivo para evaluar las etapas de progresión de la EHGNA, centrándonos predominantemente en la red vascular hepática debido a su participación significativa en la desregulación hepática relacionada con la EHGNA. Esta metodología de imagen permite el análisis longitudinal de la esteatosis hepática y la captación de tejido funcional, así como la evaluación del volumen sanguíneo relativo, el diámetro de la vena porta y la densidad de la red vascular. Comprender las adaptaciones de la red vascular hepática durante la progresión de la EHGNA y correlacionarla con otras formas de caracterizar la progresión de la enfermedad (esteatosis, inflamación, fibrosis) utilizando el método propuesto puede allanar el camino hacia el establecimiento de enfoques nuevos, más eficientes y reproducibles para la investigación de la EHGNA en ratones. También se espera que este protocolo mejore el valor de los modelos animales preclínicos para investigar el desarrollo de nuevas terapias contra la progresión de la enfermedad.
Introduction
La enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) es una enfermedad metabólica que afecta aproximadamente al 25% de la población y al >80% de las personas con obesidad mórbida1. Se estima que un tercio de estos individuos progresan a esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), que se caracteriza por esteatosis hepática, inflamación y fibrosis2. La EHNA es un estadio de la enfermedad con un riesgo significativamente mayor de desarrollar cirrosis y carcinoma hepatocelular (CHC)3,4. Por esta razón, la EHNA es actualmente la segunda causa más común de trasplante hepático, y también se espera que pronto se convierta en el predictor más importante de trasplante hepático 5,6,7. A pesar de su prevalencia y gravedad, no se dispone de una terapia específica para la EHGNA, y los tratamientos existentes solo tienen como objetivo abordar patologías asociadas a la enfermedad, como la resistencia a la insulina y la hiperlipidemia 5,6.
En los últimos años, el papel fisiopatológico y las adaptaciones del endotelio y, en general, de la red vascular de tejidos metabólicos, como el tejido adiposo y el hígado, han ido ganando mayor importancia en la investigación, especialmente durante la obesidad y la desregulación metabólica 7,8. El endotelio es una monocapa celular que recubre internamente la red vascular, actuando como una barrera funcional y estructural. También contribuye a diversos procesos fisiológicos y patológicos, como la trombosis, el transporte de metabolitos, la inflamación y la angiogénesis 9,10. En el caso del hígado, la red vascular se caracteriza, entre otras características, por la presencia de células altamente especializadas, definidas como células endoteliales sinusoidales hepáticas (LSEC). Estas células carecen de membrana basal y tienen múltiples fenestras, lo que permite una transferencia más fácil de sustratos entre la sangre y el parénquima hepático. Debido a su ubicación anatómica y características distintivas, es probable que los LSEC tengan un papel crucial en los procesos fisiopatológicos del hígado, incluido el desarrollo de inflamación y fibrosis hepática durante la EHGNA/EHNA. De hecho, las adaptaciones patológicas, moleculares y celulares que experimentan las LSEC en el curso de la EHGNA contribuyen a la progresión de la enfermedad11. Específicamente, la angiogénesis hepática dependiente de LSEC que tiene lugar durante la EHGNA se asocia significativamente con el desarrollo de inflamación y la progresión de la enfermedad a EHNA o incluso CHC12. Además, la EHGNA temprana relacionada con la obesidad se caracteriza por el desarrollo de resistencia a la insulina en los LSEC, que precede al desarrollo de inflamación hepática u otros signos avanzados de EHGNA13.
Además, los LSEC han surgido recientemente como reguladores centrales del flujo sanguíneo hepático y de las adaptaciones de la red vascular durante la enfermedad hepática de diversas etiologías14,15. De hecho, la enfermedad hepática crónica se caracteriza por una vasoconstricción intrahepática prominente y un aumento de la resistencia al flujo sanguíneo, lo que contribuye al desarrollo de hipertensión portal16. En el caso de la EHGNA, varios mecanismos relacionados con la LSEC contribuyen a este fenómeno. Por ejemplo, la resistencia a la insulina específica de LSEC, como se mencionó anteriormente, se asocia con una vasodilatación insulinodependiente reducida de la vasculatura hepática13. Además, en el transcurso de la enfermedad, la vasculatura hepática se vuelve más sensible a los vasoconstrictores, lo que contribuye aún más al deterioro del flujo sanguíneo hepático y conduce a la aparición de esfuerzos de cizallamiento, que resultan en una interrupción de la microcirculación sinusoidal17. Estos hechos sugieren que la vasculatura es un objetivo clave en la enfermedad hepática. Sin embargo, los factores limitantes que dificultan el diagnóstico oportuno y el seguimiento de la EHGNA/EHNA, así como el desarrollo de posibles terapias, son las insuficiencias en la caracterización coherente del microambiente hepático y la estructura (micro)vascular, así como la puntuación del estadio de la enfermedad de forma espaciotemporal y no invasiva.
Las imágenes de microtomografía computarizada (TC) son actualmente el método de imagen no invasivo de referencia para representar con precisión la información anatómica dentro de un organismo vivo. La microtomografía computarizada y la resonancia magnética representan dos métodos de imagen complementarios que pueden cubrir una amplia gama de patologías y proporcionar una resolución y un detalle excepcionales en las estructuras y tejidos de los que se obtienen imágenes. La microtomografía computarizada, en particular, es una herramienta muy rápida y precisa que se utiliza a menudo para estudiar patologías como las enfermedades óseas y los cambios en la superficie ósea asociados18, evaluar la progresión de la fibrosis pulmonar a lo largo del tiempo19, diagnosticar el cáncer de pulmón y su estadificación20, o incluso examinar patologías dentales21, sin ninguna preparación especial (o destrucción) de las muestras que se están fotografiando.
La tecnología de imagen de la micro-TC se basa en las diferentes propiedades de atenuación de varios órganos en términos de la interacción de los rayos X con la materia. Los órganos que presentan altas diferencias en la atenuación de los rayos X se representan con alto contraste en las imágenes de TC (es decir, los pulmones aparecen oscuros y los huesos claros). Los órganos que presentan propiedades de atenuación muy similares (diferentes tejidos blandos), son difíciles de distinguir en las imágenes de TC22. Para abordar esta limitación, se han investigado ampliamente los agentes de contraste especializados basados en yodo, oro y bismuto para su uso in vivo . Estos agentes alteran las propiedades de atenuación de los tejidos en los que se acumulan, se eliminan lentamente de la circulación y permiten la opacificación uniforme y estable de todo el sistema vascular o de los tejidos seleccionados23.
En el diagnóstico humano, la TC y técnicas comparables, como la fracción de grasa de densidad de protones derivada de la RM, ya se utilizan para la determinación del contenido de grasa hepática24,25. En el contexto de la EHGNA, el alto contraste de los tejidos blandos es esencial para distinguir con precisión las lesiones patológicas o los vasos pequeños. Para ello, se utilizan agentes de contraste que proporcionan un mayor contraste de las características del tejido hepático. Estas herramientas y materiales permiten el estudio de múltiples características hepáticas y posibles expresiones patológicas, como la arquitectura y densidad de la red vascular, el depósito de lípidos/esteatosis y la captación de tejidos funcionales/transferencia de lípidos (quilomicrones) en el hígado. Además, también se puede evaluar el volumen sanguíneo relativo hepático y el diámetro de la vena porta. En un tiempo de exploración muy corto, todos estos parámetros proporcionan información diferente y complementaria sobre la evaluación y progresión de la EHGNA, que puede utilizarse para desarrollar un diagnóstico no invasivo y detallado.
En este artículo, proporcionamos un protocolo paso a paso para el uso de nuevas técnicas de imagen de micro-TC in vivo como un método no invasivo para evaluar las etapas de progresión de la EHGNA. Con este protocolo, el análisis longitudinal de la esteatosis hepática y la captación de tejido funcional, así como la evaluación del volumen sanguíneo relativo, el diámetro de la vena porta y la densidad de la red vascular, se pueden realizar y aplicar en modelos murinos de enfermedad hepática.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método recomendado actualmente para el diagnóstico y la estadificación de la EHGNA en humanos es la biopsia hepática, que conlleva el riesgo de complejidades hemorrágicas, así como de imprecisiones en el muestreo40. Por el contrario, en modelos animales, dicho diagnóstico se realiza por histología post-mortem, aunque ya se dispone de protocolos para la biopsia hepática con capacidad de supervivencia y se recomiendan cuando el diseño del estudio lo permite41. El…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La figura 1 se creó con BioRender.com. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Helénica para la Investigación y la Innovación (#3222 a A.C.). Anna Hadjihambi está financiada por el Instituto Roger Williams de Hepatología, Fundación para la Investigación del Hígado.
Materials
| eXIA160 | Binitio Biomedical, Inc. | https://www.binitio.com/?Page=Products | |
| High fat diet with 60% of kilocalories from fat | Research Diets, New Brunswick, NJ, USA | D12492 | |
| High-fructose corn syrup | Best flavors, CA | hfcs-1gallon | |
| Lacrinorm ophthalmic ointment | Bausch & Lomb | ||
| Normal diet with 10% of kilocalories from fat | Research Diets, New Brunswick, NJ, USA | D12450 | |
| Viscover ExiTron nano 12000 | Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-698 | |
| VivoQuant | Invicro | ||
| X-CUBE | Molecubes, Belgium | https://www.molecubes.com/systems/ |
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