Nya in vivo mikrodatortomografiavbildningstekniker för att bedöma progressionen av icke-alkoholisk fettleversjukdom

Summary

Med hjälp av en dietinducerad icke-alkoholisk fettleversjukdom (NAFLD) musmodell beskriver vi användningen av nya in vivo mikrodatortomografiavbildningstekniker som en icke-invasiv metod för att bedöma progressionsstadierna av NAFLD, med övervägande fokus på det hepatiska vaskulära nätverket på grund av dess betydande engagemang i NAFLD-relaterad leverdysreglering.

Abstract

Icke-alkoholisk fettleversjukdom (NAFLD) är ett växande globalt hälsoproblem, och effekterna av NAFLD förvärras av den nuvarande bristen på effektiva behandlingar. Avsevärda begränsande faktorer som hindrar snabb och korrekt diagnos (inklusive gradering) och övervakning av NAFLD, liksom utvecklingen av potentiella terapier, är de nuvarande bristerna i karakteriseringen av leverns mikromiljöstruktur och poängsättningen av sjukdomsstadiet på ett spatiotemporalt och icke-invasivt sätt. Med hjälp av en dietinducerad NAFLD-musmodell undersökte vi användningen av in vivo mikrodatortomografi (CT) avbildningstekniker som en icke-invasiv metod för att bedöma progressionsstadierna av NAFLD, med övervägande fokus på det hepatiska vaskulära nätverket på grund av dess betydande involvering i NAFLD-relaterad leverdysreglering. Denna avbildningsmetodik möjliggör longitudinell analys av leversteatos och funktionellt vävnadsupptag, samt utvärdering av den relativa blodvolymen, portvendiametern och densiteten i det vaskulära nätverket. Att förstå anpassningarna av det hepatiska vaskulära nätverket under NAFLD-progression och korrelera detta med andra sätt att karakterisera sjukdomsprogressionen (steatos, inflammation, fibros) med hjälp av den föreslagna metoden kan bana väg för etableringen av nya, mer effektiva och reproducerbara metoder för NAFLD-forskning på möss. Detta protokoll förväntas också uppgradera värdet av prekliniska djurmodeller för att undersöka utvecklingen av nya terapier mot sjukdomsprogression.

Introduction

Icke-alkoholisk fettleversjukdom (NAFLD) är en metabol sjukdom som drabbar cirka 25 % av befolkningen och >80 % av sjukligt överviktiga personer¹. Uppskattningsvis en tredjedel av dessa individer utvecklar till icke-alkoholisk steatohepatit (NASH), som kännetecknas av leversteatos, inflammation och fibros². NASH är ett sjukdomsstadium med en signifikant högre risk för utveckling av cirros och hepatocellulärt karcinom (HCC)^3,4. Av denna anledning är NASH för närvarande den näst vanligaste orsaken till levertransplantation, och den förväntas också snart bli den viktigaste prediktorn för levertransplantation ^5,6,7. Trots dess förekomst och svårighetsgrad finns ingen sjukdomsspecifik behandling tillgänglig för NAFLD, och de befintliga behandlingarna syftar endast till att ta itu med sjukdomsassocierade patologier som insulinresistens och hyperlipidemi ^5,6.

Under de senaste åren har endotelets patofysiologiska roll och anpassningar och i allmänhet det vaskulära nätverket av metaboliska vävnader, såsom fettvävnaden och levern, fått allt större betydelse i forskningen, särskilt vid fetma och metabol dysreglering ^7,8. Endotelet är ett cellulärt monolager som fodrar det vaskulära nätverket internt och fungerar som en funktionell och strukturell barriär. Det bidrar också till olika fysiologiska och patologiska processer, såsom trombos, metabolittransport, inflammation och angiogenes ^9,10. När det gäller levern kännetecknas det vaskulära nätverket bland annat av närvaron av högspecialiserade celler, definierade som leverns sinusformade endotelceller (LSEC). Dessa celler saknar ett basalmembran och har flera fenestrae, vilket möjliggör en enklare överföring av substrat mellan blodet och leverparenkymet. På grund av deras distinkta anatomiska läge och egenskaper har LSEC sannolikt en avgörande roll i leverns patofysiologiska processer, inklusive utvecklingen av leverinflammation och fibros under NAFLD/NASH. Faktum är att de patologiska, molekylära och cellulära anpassningar som LSEC genomgår under NAFLD bidrar till sjukdomsprogressionen¹¹. Specifikt är den LSEC-beroende leverangiogenesen som äger rum under NAFLD signifikant associerad med utvecklingen av inflammation och progressionen av sjukdomen till NASH eller till och med HCC¹². Dessutom kännetecknas fetmarelaterad tidig NAFLD av utvecklingen av insulinresistens i LSEC, som föregår utvecklingen av leverinflammation eller andra avancerade NAFLD-tecken¹³.

Dessutom har LSEC nyligen dykt upp som centrala regulatorer för leverns blodflöde och vaskulära nätverksanpassningar under leversjukdom av flera etiologier^14,15. Faktum är att kronisk leversjukdom kännetecknas av framträdande intrahepatisk vasokonstriktion och ökad motståndskraft mot blodflödet, vilket bidrar till utvecklingen av portal hypertension¹⁶. När det gäller NAFLD bidrar flera LSEC-relaterade mekanismer till detta fenomen. Till exempel är LSEC-specifik insulinresistens, som nämnts ovan, förknippad med minskad insulinberoende vasodilatation av leverns kärl¹³. Dessutom blir leverns kärl under sjukdomsförloppet känsligare för vasokonstriktorer, vilket ytterligare bidrar till försämring av blodflödet i levern och leder till uppkomsten av skjuvspänning, vilket båda resulterar i en störning av den sinusformade mikrocirkulationen¹⁷. Dessa fakta tyder på att kärlen är ett viktigt mål vid leversjukdom. Begränsande faktorer som hindrar snabb diagnos och övervakning av NAFLD/NASH, liksom utvecklingen av potentiella terapier, är dock bristerna i den konsekventa karakteriseringen av leverns mikromiljö och (mikro)vaskulära struktur, samt poängsättningen av sjukdomsstadiet på ett spatiotemporalt och icke-invasivt sätt.

Mikrodatortomografi (CT) är för närvarande den gyllene standarden för icke-invasiv avbildningsmetod för att exakt avbilda anatomisk information i en levande organism. Mikro-CT och MRT representerar två kompletterande avbildningsmetoder som kan täcka ett brett spektrum av patologier och ge exceptionell upplösning och detaljrikedom i de avbildade strukturerna och vävnaderna. Micro-CT, i synnerhet, är ett mycket snabbt och exakt verktyg som ofta används för att studera patologier som bensjukdomar och tillhörande förändringar på benytan¹⁸, bedöma utvecklingen av lungfibros över tid¹⁹, diagnostisera lungcancer och dess stadieindelning²⁰, eller till och med undersöka tandpatologier²¹, utan någon speciell förberedelse (eller förstörelse) av proverna som avbildas.

Avbildningstekniken för mikro-CT är baserad på de olika dämpningsegenskaperna hos olika organ när det gäller röntgenstrålars interaktion med materia. Organ som uppvisar stora skillnader i röntgendämpning avbildas med hög kontrast i CT-bilder (dvs. lungorna ser mörka ut och benen ljusa). Organ som uppvisar mycket likartade dämpningsegenskaper (olika mjukvävnader) är svåra att urskilja på CT-bilder²². För att ta itu med denna begränsning har specialiserade kontrastmedel baserade på jod, guld och vismut undersökts i stor utsträckning för in vivo-användning . Dessa medel förändrar dämpningsegenskaperna hos de vävnader i vilka de ackumuleras, rensas långsamt från cirkulationen och möjliggör en enhetlig och stabil opacifiering av hela kärlsystemet eller utvalda vävnader²³.

Inom humandiagnostik används redan datortomografi och jämförbara tekniker, t.ex. MRT-härledd fettfraktion med protondensitet, för bestämning av leverfetthalt^24,25. I samband med NAFLD är hög mjukvävnadskontrast avgörande för att korrekt särskilja patologiska lesioner eller små kärl. För detta ändamål används kontrastmedel som ger ökad kontrast av levervävnadens egenskaper. Sådana verktyg och material gör det möjligt att studera flera leveregenskaper och möjliga patologiska uttryck, såsom kärlnätverkets arkitektur och densitet, lipidavsättning/steatos och funktionellt vävnadsupptag/lipidöverföring (kylomikron) i levern. Dessutom kan leverns relativa blodvolym och portvendiameter också utvärderas. På mycket kort skanningstid ger alla dessa parametrar olika och kompletterande information om utvärdering och progression av NAFLD, som kan användas för att utveckla en icke-invasiv och detaljerad diagnos.

I den här artikeln tillhandahåller vi ett steg-för-steg-protokoll för användning av nya in vivo mikro-CT-avbildningstekniker som en icke-invasiv metod för att bedöma progressionsstadierna av NAFLD. Med hjälp av detta protokoll kan den longitudinella analysen av leversteatos och funktionellt vävnadsupptag, samt utvärderingen av den relativa blodvolymen, portvendiametern och densiteten i det vaskulära nätverket, utföras och tillämpas i musmodeller av leversjukdom.

Protocol

Alla procedurer utfördes av BIOEMTECHs personal i enlighet med europeiska och nationella djurskyddsbestämmelser och godkändes av nationella myndigheter (licensnummer EL 25, BIOexp 45/PN 49553 21/01/20). Alla experiment utformades och rapporterades i enlighet med ARRIVE-riktlinjerna26. Mössen köptes från Hellenic Pasteur Institute i Aten, Grekland. OBS: Djuren inhystes i individuellt ventilerade burar berikade med skenor och papprör i ett rum vid 20-22 °C, med en…

Representative Results

I denna representativa studie indikerade mikro-CT-avbildning utan kontrastmedel en högre andel leverfett hos möss med NAFLD jämfört med kontroller (tabell 2), vilket bekräftar patologin. Med hjälp av kontrastmedlet ExiTron och den vaskulära nätverksarkitekturen och densitetsanalysen i levern som beskrivs ovan, visade sig den totala volymtätheten i det hepatiska vaskulära nätverket vara högre hos möss med NAFLD jämfört med friska kontroller (Figur 6, ta…

Discussion

Den för närvarande rekommenderade metoden för NAFLD-diagnos och stadieindelning på människor är leverbiopsi, som medför risk för blödningskomplexitet, samt provtagningsfelaktigheter⁴⁰. Tvärtom, i djurmodeller utförs sådan diagnos genom histologi post-mortem, även om protokoll för överlevnadsbar leverbiopsi nu finns tillgängliga och rekommenderas när studiedesignen tillåter⁴¹. Användningen av histologi efter döden innebär att ett stort antal djur krävs …

Materials

eXIA160	Binitio Biomedical, Inc.		https://www.binitio.com/?Page=Products
High fat diet with 60% of kilocalories from fat	Research Diets, New Brunswick, NJ, USA	D12492
High-fructose corn syrup	Best flavors, CA	hfcs-1gallon
Lacrinorm ophthalmic ointment	Bausch & Lomb
Normal diet with 10% of kilocalories from fat	Research Diets, New Brunswick, NJ, USA	D12450
Viscover ExiTron nano 12000	Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-095-698
VivoQuant	Invicro
X-CUBE	Molecubes, Belgium		https://www.molecubes.com/systems/