Immunfärbungsbasierter Nachweis dynamischer Veränderungen in Erythrozytenproteinen
Summary
Die Erfassung dynamischer Veränderungen in der Proteinaktivierung entkernter roter Blutkörperchen stellt methodische Herausforderungen dar, wie z.B. die Konservierung dynamischer Veränderungen akuter Stimuli für eine spätere Bewertung. Das vorgestellte Protokoll beschreibt Probenvorbereitungs- und Färbetechniken, die die Konservierung und Analyse relevanter Proteinveränderungen und den anschließenden Nachweis ermöglichen.
Abstract
Die Antikörpermarkierung von Erythrozytenproteinen (RBC) ist eine häufig verwendete, semiquantitative Methode, um Veränderungen des Gesamtproteingehalts oder akute Veränderungen der Proteinaktivierungszustände zu erkennen. Es erleichtert die Beurteilung von Erythrozytenbehandlungen, die Charakterisierung von Unterschieden in bestimmten Krankheitszuständen und die Beschreibung zellulärer Kohärenzen. Der Nachweis einer akut veränderten Proteinaktivierung (z.B. durch Mechanotransduktion) erfordert eine adäquate Probenvorbereitung, um ansonsten temporäre Proteinmodifikationen zu erhalten. Das Grundprinzip beinhaltet die Immobilisierung der Zielbindungsstellen der gewünschten Erythrozytenproteine, um die initiale Bindung spezifischer Primärantikörper zu ermöglichen. Die Probe wird weiterverarbeitet, um optimale Bedingungen für die Bindung des Sekundärantikörpers an den entsprechenden Primärantikörper zu gewährleisten. Die Auswahl von nicht-fluoreszierenden Sekundärantikörpern erfordert eine zusätzliche Behandlung, einschließlich der Biotin-Avidin-Kopplung und der Anwendung von 3,3-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB), um die Färbung zu entwickeln, die in Echtzeit unter dem Mikroskop kontrolliert werden muss, um die Oxidation und damit die Färbeintensität rechtzeitig zu stoppen. Für die Detektion der Färbeintensität werden Bilder mit einem Standard-Lichtmikroskop aufgenommen. In einer Modifikation dieses Protokolls kann stattdessen ein Fluorescein-konjugierter Sekundärantikörper eingesetzt werden, was den Vorteil hat, dass kein weiterer Entwicklungsschritt notwendig ist. Dieses Verfahren erfordert jedoch ein Fluoreszenzobjektiv, das an einem Mikroskop befestigt ist, um die Färbung zu detektieren. Angesichts des semi-quantitativen Charakters dieser Methoden ist es unerlässlich, mehrere Kontrollfärbungen bereitzustellen, um unspezifische Antikörperreaktionen und Hintergrundsignale zu berücksichtigen. Hier stellen wir sowohl Färbeprotokolle als auch die entsprechenden analytischen Verfahren vor, um die jeweiligen Ergebnisse und Vorteile der verschiedenen Färbetechniken zu vergleichen und zu diskutieren.
Introduction
Rote Blutkörperchen (RBCs) durchqueren das Herz-Kreislauf-System 70 bis 140 Tage lang, mit einem mittleren Erythrozytenalter von etwa 115 Tagen 1,2. Seneszente oder beschädigte Erythrozyten werden durch Erythrophagozytose, einen effizienten Clearing-Prozess, der von Makrophagen angetrieben wird, aus dem Kreislauf entfernt3. Die vorgegebene Lebensdauer dieser Zellen ist eine Folge der Abgabe der Zellorganellen, einschließlich des Zellkerns, der Mitochondrien und der Ribosomen, während der Differenzierung und Reifung4. Daher sind zirkulierende Erythrozyten frei von einer Translationsmaschinerie, was die Synthese neuer Proteine ausschließt3. Daraus folgt, dass dynamische, posttranslationale Modifikationen an bestehenden Proteinen den einzigen praktikablen Mechanismus der akuten, biochemischen Regulation als Reaktion auf extrazelluläre und intrazelluläre Stressoren darstellen, die auf Erythrozyten einwirken5.
Mechanische Kräfte scheinen die wichtigsten extrazellulären Signale zu sein, die die Aktivierung oder Modulation biochemischer Signalwege innerhalb von Erythrozyten verursachen. Die Entdeckung des mechanosensitiven Proteins Piezo1 in Erythrozytenmembranen6 inspirierte mehrere Forschungslinien, die die mechanisch aktivierte Signalübertragung in diesen Zellen untersuchten7. Jüngste Fortschritte haben beispielsweise gezeigt, dass die physikalischen Eigenschaften von Erythrozyten aktiv durch akute und dynamische Veränderungen von Proteinenreguliert werden 8, einschließlich der posttranslationalen Phosphorylierung und Ubiquitinierung9. Da sich diese normalen Modifikationen bei bestimmten Erkrankungen unterscheiden 9,10,11, scheint es von wissenschaftlichem und klinischem Interesse zu sein, den Aktivierungszustand von Erythrozytenproteinen zu bestimmen, insbesondere in Bezug auf mechanobiologische Prozesse.
Die Bestimmung akuter Veränderungen in den Aktivierungszuständen von Erythrozytenproteinen bringt einige methodische Herausforderungen mit sich. Zum Beispiel erfordert die Lagerung von Erythrozytenproben für die spätere Analyse die Konservierung der modifizierten Erythrozytenproteine, da posttranslationale Modifikationen nicht dauerhaft sind. Darüber hinaus sind klassische Proteinnachweismethoden (z. B. Western Blotting) in Erythrozyten aufgrund der geringen Häufigkeit von Proteinen im Vergleich zum Hämoglobin, das ~98% des Proteingehalts in diesen Zellen ausmacht, notorisch schwer zu standardisieren12. Daher ist die Antikörper-basierte Färbung chemisch konservierter Erythrozyten die Methode der Wahl bei der Untersuchung akuter Modifikationen wichtiger Erythrozytenproteine, wie z. B. der RBC-spezifischen Isoform der Stickstoffmonoxid-Synthase (RBC-NOS)13,14. Es wurde gezeigt, dass Erythrozyten-NOS enzymatisch Stickstoffmonoxid (NO) produziert, das für wesentliche Erythrozyteneigenschaften, einschließlich der Erythrozytenverformbarkeit, unverzichtbar zu seinscheint 15,16,17. Posttranslationale Modifikationen von RBC-NOS regulieren die katalytische Enzymaktivität, wobei die Phosphorylierung des Serin-1177-Rests beschrieben wird, um die Enzymaktivität zu erhöhen, während die Phosphorylierung der Reste Serin 114 oder Threonin 495 mit einer verminderten RBC-NOS-Aktivität in Verbindung gebracht wurde18,19.
Insgesamt tragen temporäre Modifikationen von Erythrozytenproteinen zu einer wichtigen zellulären Funktion bei, und standardisierte Protokolle, die den Nachweis dieser modifizierten Proteine ermöglichen, sind von großem Wert. In dieser Arbeit stellen wir zwei unterschiedliche Protokolle vor, die spezifische Antikörper nutzen, um den Nachweis der Aktivierung des RBC-NOS-Proteins zu erleichtern, und diskutieren Empfehlungen für die Datenanalyse und -interpretation.
Die Leistung der beschriebenen Protokolle wurde durch Messung des gut berichteten Anstiegs der Phosphorylierung von RBC-NOS am Serin-1177-Rest als Reaktion auf mechanische Kräfte bewertet, die die im menschlichen Gefäßsystem auftretenden Kräfte widerspiegeln (5 Pa).
Protocol
Representative Results
Discussion
Neuere Literatur deutet stark darauf hin, dass das Erythrozyten-NOS-Protein von entscheidender Bedeutung für die Regulation der Verformbarkeit von Erythrozytenist 15,22,23, was wiederum ihre Passage durch enge Kapillaren erleichtert 24. Die Proteinaktivität hängt in hohem Maße von posttranslationalen Proteinmodifikationen ab, insbesondere von der Phosphorylierung bestimmter Reste18</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LK bedankt sich für die Unterstützung durch ein Stipendium des australischen Forschungsausbildungsprogramms.
Materials
| 3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate | Sigma/Merck | D5637 | DAB |
| Ammoniumchloride | Merck /Millipore | 101145 | NH4Cl |
| Centrifuge 5427 R | Eppendorf | 5409000010 | |
| Coverslips | VWR | 631-0147 | |
| di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate | Merck /Millipore | 106580 | Na2HPO4. 2 H2O |
| Disposable transfer pipettes | VWR | 612-6803 | |
| Entellan | Merck /Millipore | 107961 | rapid mounting medium for microscopy |
| Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK) | Hofmann | 642 | |
| Glucose-Oxidase | Sigma/Merck | G2133 | |
| Grease pencil | Dako | S 2002 | |
| Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase | Sigma/Merck | E-2886 | HRP |
| Hydrochloric acid | Merck /Millipore | 109057 | HCl |
| Hydrogen peroxide, 30% | Merck /Millipore | 107203 | H2O2 |
| ImageJ Software | Freeware | ||
| Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA) | RR Mechatronics | Ektacytometer instrument used for shearing | |
| Methanol | Merck /Millipore | 106009 | |
| Microscope slides | VWR | 630-1985 | |
| Nickel(II)-sulfate Hexahydrate | Sigma/Merck | N4882 | NiSO4.6H2O |
| Normal Goat serum | Agilent/DAKO | X0907 | NGS |
| Paraformaldehyde | Merck /Millipore | 818715 | PFA |
| Pipettes Eppendorf Reference 2 | VWR | 613-5836/ 613-5839 | |
| Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177) | Merck/Millipore | 07-428-I | Primary Antibody |
| Reaction tubes, 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
| Secondary Antibody goat anti rabbit | Agilent/DAKO | E0432 | Secondary Antibody |
| Skim milk powder | Bio-Rad | 170-6404 | |
| Sodium chloride | Merck /Millipore | 106404 | NaCl |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck /Millipore | 106346 | NaH2PO4.H2O |
| Sodium hydroxide, 1 M | Merck /Millipore | 150706 | NaOH |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Merck /Millipore | 108382 | Tris |
| Trypsin | Sigma/Merck | T7409 | |
| Tween20 | Merck /Millipore | 822184 | |
| Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F | Merck /Millipore | WHA1825047 | |
| Xylol | VWR Chemicals | 2,89,73,465 | |
| ß-D-Glucose monohydrate | Merck /Millipore | 14431-43-7 |
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