Immunfargingsbasert påvisning av dynamiske endringer i røde blodcelleproteiner
Summary
Å fange dynamiske endringer i proteinaktiveringen av enucleated røde blodlegemer utgjør metodologiske utfordringer, som bevaring av dynamiske endringer i akutte stimuli for senere vurdering. Den presenterte protokollen beskriver prøvepreparering og fargeteknikker som muliggjør bevaring og analyse av relevante proteinendringer og påfølgende deteksjon.
Abstract
Antistoffmerking av røde blodlegemer (RBC) proteiner er en ofte brukt, semi-kvantitativ metode for å oppdage endringer i totalt proteininnhold eller akutte endringer i proteinaktiveringstilstander. Det letter vurderingen av RBC-behandlinger, karakterisering av forskjeller i visse sykdomstilstander og beskrivelse av cellulære sammenhenger. Påvisning av akutt endret proteinaktivering (f.eks. gjennom mekanotransduksjon) krever tilstrekkelig prøvepreparering for å bevare ellers midlertidige proteinmodifikasjoner. Det grunnleggende prinsippet inkluderer immobilisering av målbindingsstedene til de ønskede RBC-proteinene for å muliggjøre den første bindingen av spesifikke primære antistoffer. Prøven behandles videre for å garantere optimale betingelser for binding av det sekundære antistoffet til det tilsvarende primære antistoffet. Valget av ikke-fluorescerende sekundære antistoffer krever ytterligere behandling, inkludert biotin-avidin-kobling og påføring av 3,3-diaminobenzidin-tetrahydroklorid (DAB) for å utvikle fargingen, som må kontrolleres i sanntid under et mikroskop for å stoppe oksidasjonen, og dermed fargeintensiteten, i tide. For deteksjon av fargeintensitet tas bildene med et standard lysmikroskop. I en modifikasjon av denne protokollen kan et fluoresceinkonjugert sekundært antistoff påføres i stedet, noe som har fordelen at ingen videre utviklingstrinn er nødvendig. Denne prosedyren krever imidlertid et fluorescensmål festet til et mikroskop for fargingsdeteksjon. Gitt den semi-kvantitative karakteren av disse metodene, er det viktig å gi flere kontrollflekker for å ta hensyn til ikke-spesifikke antistoffreaksjoner og bakgrunnssignaler. Her presenterer vi både fargeprotokoller og tilhørende analytiske prosesser for å sammenligne og diskutere de respektive resultatene og fordelene ved de forskjellige fargeteknikkene.
Introduction
Røde blodlegemer (RBC) krysser kardiovaskulærsystemet i 70 til 140 dager, med en gjennomsnittlig RBC-alder på ca. 115 dager 1,2. Senescent eller skadede RBC fjernes fra sirkulasjonen ved erytrofagocytose, en effektiv clearingprosess drevet av makrofager3. Den forhåndsbestemte levetiden til disse cellene er en konsekvens av å overgi celleorganellene, inkludert kjernen, mitokondriene og ribosomene, under differensiering og modning4. Dermed er sirkulerende RBC blottet for et translasjonsmaskineri, og utelukker syntesen av nye proteiner3. Det følger at dynamiske, posttranslasjonelle modifikasjoner av eksisterende proteiner representerer den eneste levedyktige mekanismen for akutt, biokjemisk regulering som respons på ekstracellulære og intracellulære stressorer som virker på RBC5.
Mekaniske krefter ser ut til å være viktigste ekstracellulære signaler som forårsaker aktivering eller modulering av biokjemiske veier i RBC. Oppdagelsen av det mekanosensitive proteinet, Piezo1, i RBC-membraner6 inspirerte flere forskningslinjer som undersøkte mekanisk aktivert signalering i disse cellene7. For eksempel har nyere fremskritt vist at de fysiske egenskapene til RBC er aktivt regulert av akutte og dynamiske endringer av proteiner8, som inkluderer posttranslasjonell fosforylering og ubiquitinering9. Siden disse normale modifikasjonene er forskjellige i visse sykdommer 9,10,11, synes det å være av vitenskapelig og klinisk interesse å bestemme aktiveringstilstanden til RBC-proteiner, spesielt i forhold til mekanobiologiske prosesser.
Bestemmelsen av akutte endringer i RBC-proteinaktiveringstilstander utgjør noen metodologiske utfordringer. For eksempel krever lagring av RBC-prøver for senere analyse bevaring av de modifiserte RBC-proteinene, da posttranslasjonelle modifikasjoner ikke er holdbare. Videre er klassiske proteindeteksjonsmetoder (f.eks. Vestlig blotting) notorisk vanskelige å standardisere i RBC på grunn av den lave overflod av proteiner i forhold til hemoglobin, som står for ~ 98% av proteininnholdet i disse cellene12. Dermed har antistoffbasert farging av kjemisk bevarte RBC vært den valgte metoden ved undersøkelse av akutte modifikasjoner av viktige RBC-proteiner, som RBC-spesifikk isoform av nitrogenoksidsyntase (RBC-NOS)13,14. RBC-NOS har vist seg å produsere nitrogenoksid (NO) enzymatisk, noe som virker uunnværlig for essensielle RBC-egenskaper, inkludert RBC-deformabilitet15,16,17. Posttranslasjonelle modifikasjoner av RBC-NOS regulerer katalytisk enzymaktivitet, med fosforylering av serin 1177-resten beskrevet for å øke enzymaktiviteten, mens fosforylering av restene serin 114 eller treonin 495 har vært knyttet til redusert RBC-NOS-aktivitet18,19.
Samlet bidrar midlertidige modifikasjoner av RBC-proteiner til viktig cellulær funksjon, og standardiserte protokoller som muliggjør deteksjon av disse modifiserte proteinene er av høy verdi. Her presenterer vi to forskjellige protokoller som utnytter spesifikke antistoffer for å lette påvisning av RBC-NOS-proteinaktivering, og diskuterer anbefalinger for dataanalyse og tolkning.
Utførelsen av de beskrevne protokollene ble vurdert ved å måle den godt rapporterte økningen i fosforyleringen av RBC-NOS ved serin 1177-resten som respons på mekaniske krefter som reflekterer de som forekommer i den humane vaskulaturen (5 Pa).
Protocol
Representative Results
Discussion
Nyere litteratur tyder sterkt på at RBC-NOS-proteinet er av avgjørende betydning for reguleringen av RBC-deformabilitet 15,22,23, noe som igjen letter passasjen gjennom smale kapillærer 24. Proteinaktivitet avhenger sterkt av posttranslasjonelle proteinmodifikasjoner, spesielt fosforylering av visse rester18. Fokuset av interesse ligger i fosforyleringsstedet 1177, som relatere…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LK anerkjenner støtten fra et australsk regjeringsstipend for forskningsopplæringsprogram.
Materials
| 3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate | Sigma/Merck | D5637 | DAB |
| Ammoniumchloride | Merck /Millipore | 101145 | NH4Cl |
| Centrifuge 5427 R | Eppendorf | 5409000010 | |
| Coverslips | VWR | 631-0147 | |
| di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate | Merck /Millipore | 106580 | Na2HPO4. 2 H2O |
| Disposable transfer pipettes | VWR | 612-6803 | |
| Entellan | Merck /Millipore | 107961 | rapid mounting medium for microscopy |
| Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK) | Hofmann | 642 | |
| Glucose-Oxidase | Sigma/Merck | G2133 | |
| Grease pencil | Dako | S 2002 | |
| Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase | Sigma/Merck | E-2886 | HRP |
| Hydrochloric acid | Merck /Millipore | 109057 | HCl |
| Hydrogen peroxide, 30% | Merck /Millipore | 107203 | H2O2 |
| ImageJ Software | Freeware | ||
| Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA) | RR Mechatronics | Ektacytometer instrument used for shearing | |
| Methanol | Merck /Millipore | 106009 | |
| Microscope slides | VWR | 630-1985 | |
| Nickel(II)-sulfate Hexahydrate | Sigma/Merck | N4882 | NiSO4.6H2O |
| Normal Goat serum | Agilent/DAKO | X0907 | NGS |
| Paraformaldehyde | Merck /Millipore | 818715 | PFA |
| Pipettes Eppendorf Reference 2 | VWR | 613-5836/ 613-5839 | |
| Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177) | Merck/Millipore | 07-428-I | Primary Antibody |
| Reaction tubes, 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
| Secondary Antibody goat anti rabbit | Agilent/DAKO | E0432 | Secondary Antibody |
| Skim milk powder | Bio-Rad | 170-6404 | |
| Sodium chloride | Merck /Millipore | 106404 | NaCl |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck /Millipore | 106346 | NaH2PO4.H2O |
| Sodium hydroxide, 1 M | Merck /Millipore | 150706 | NaOH |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Merck /Millipore | 108382 | Tris |
| Trypsin | Sigma/Merck | T7409 | |
| Tween20 | Merck /Millipore | 822184 | |
| Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F | Merck /Millipore | WHA1825047 | |
| Xylol | VWR Chemicals | 2,89,73,465 | |
| ß-D-Glucose monohydrate | Merck /Millipore | 14431-43-7 |
References
- Cohen, R. M., et al. Red cell life span heterogeneity in hematologically normal people is sufficient to alter HbA1c. Blood. 112 (10), 4284-4291 (2008).
- Mock, D. M., et al. Red blood cell (RBC) survival determined in humans using RBCs labeled at multiple biotin densities. Transfusion. 51 (5), 1047-1057 (2011).
- Thiagarajan, P., Parker, C. J., Prchal, J. T. How do red blood cells die?. Frontiers in Physiology. 12, 655393 (2021).
- Moras, M., Lefevre, S. D., Ostuni, M. A. From erythroblasts to mature red blood cells: organelle clearance in mammals. Frontiers in Physiology. 8, 1076 (2017).
- Pretini, V., et al. Red blood cells: chasing interactions. Frontiers in Physiology. 10, 945 (2019).
- Cahalan, S. M., et al. Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume. eLife. 4, e07370 (2015).
- Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Piezo1 regulates shear-dependent nitric oxide production in human erythrocytes. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 323 (1), H24-H37 (2022).
- Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Active modulation of human erythrocyte mechanics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (2), C250-C257 (2020).
- Strader, M. B., et al. Post-translational modification as a response to cellular stress induced by hemoglobin oxidation in sickle cell disease. Scientific Reports. 10 (1), 14218 (2020).
- Pecankova, K., Majek, P., Cermak, J., Dyr, J. E. Posttranslational modifications of red blood cell ghost proteins as "signatures" for distinguishing between low- and high-risk myelodysplastic syndrome patients. Turkish Journal of Haematology. 34 (1), 111-113 (2017).
- Grau, M., et al. High red blood cell nitric oxide synthase activation is not associated with improved vascular function and red blood cell deformability in sickle cell anaemia. British Journal of Haematology. 168 (5), 728-736 (2015).
- Sae-Lee, W., et al. The protein organization of a red blood cell. Cell Reports. 40 (3), 111103 (2022).
- Suhr, F., et al. Moderate exercise promotes human RBC-NOS activity, NO production and deformability through Akt kinase pathway. PLoS One. 7 (9), e45982 (2012).
- Kuck, L., Grau, M., Bloch, W., Simmonds, M. J. Shear stress ameliorates superoxide impairment to erythrocyte deformability with concurrent nitric oxide synthase activation. Frontiers in Physiology. 10, 36 (2019).
- Grau, M., et al. RBC-NOS-dependent S-nitrosylation of cytoskeletal proteins improves RBC deformability. PLoS One. 8 (2), e56759 (2013).
- Simmonds, M. J., Detterich, J. A., Connes, P. Nitric oxide, vasodilation and the red blood cell. Biorheology. 51 (2-3), 121-134 (2014).
- Bor-Kucukatay, M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Effects of nitric oxide on red blood cell deformability. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 284 (5), H1577-H1584 (2003).
- Suhr, F., et al. Intensive exercise induces changes of endothelial nitric oxide synthase pattern in human erythrocytes. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 20 (2), 95-103 (2009).
- Grau, M., et al. Regulation of red blood cell deformability is independent of red blood cell-nitric oxide synthase under hypoxia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 63 (3), 199-215 (2016).
- Grau, M., Kuck, L., Dietz, T., Bloch, W., Simmonds, M. J. Sub-fractions of red blood cells respond differently to shear exposure following superoxide treatment. Biologie. 10 (1), 47 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ozüyaman, B., Grau, M., Kelm, M., Merx, M. W., Kleinbongard, P. RBC NOS: regulatory mechanisms and therapeutic aspects. Trends in Molecular Medicine. 14 (7), 314-322 (2008).
- Kleinbongard, P., et al. Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase. Blood. 107 (7), 2943-2951 (2006).
- McMahon, T. J. Red blood cell deformability, vasoactive mediators, and adhesion. Frontiers in Physiology. 10, 1417 (2019).
- Bizjak, D. A., Brinkmann, C., Bloch, W., Grau, M. Increase in red blood cell-nitric oxide synthase dependent nitric oxide production during red blood cell aging in health and disease: a study on age dependent changes of rheologic and enzymatic properties in red blood cells. PLoS One. 10 (4), 0125206 (2015).
- Di Pietro, N., et al. Nitric oxide synthetic pathway and cGMP levels are altered in red blood cells from end-stage renal disease patients. Molecular and Cellular Biochemistry. 417 (1-2), 155-167 (2016).
- Grau, M., et al. Even patients with mild COVID-19 symptoms after SARS-CoV-2 infection show prolonged altered red blood cell morphology and rheological parameters. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 26 (10), 3022-3030 (2022).
- Mozar, A., et al. Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).
- Ulker, P., Gunduz, F., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Nitric oxide generated by red blood cells following exposure to shear stress dilates isolated small mesenteric arteries under hypoxic conditions. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 54 (4), 357-369 (2013).
- Nader, E., et al. Hydroxyurea therapy modulates sickle cell anemia red blood cell physiology: Impact on RBC deformability, oxidative stress, nitrite levels and nitric oxide synthase signalling pathway. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 81, 28-35 (2018).
- Fischer, U. M., Schindler, R., Brixius, K., Mehlhorn, U., Bloch, W. Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes. The Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 2000-2003 (2007).
- Horobin, J. T., Sabapathy, S., Kuck, L., Simmonds, M. J. Shear stress and RBC-NOS Serine1177 Phosphorylation in humans: a dose response. Life. 11 (1), 36 (2021).
- Kuck, L., Grau, M., Simmonds, M. J. Recovery time course of erythrocyte deformability following exposure to shear is dependent upon conditioning shear stress. Biorheology. 54 (5-6), 141-152 (2018).
- Grau, M., et al. Effect of acute exercise on RBC deformability and RBC nitric oxide synthase signalling pathway in young sickle cell anaemia patients. Scientific Reports. 9 (1), 11813 (2019).
- Feelisch, M. . Methods in Nitric Oxide Research. , (1998).
- Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood>. 120 (20), 4229-4237 (2012).
