Выявление динамических изменений белков эритроцитов с помощью иммуноокрашивания
Summary
Регистрация динамических изменений в белковой активации энуклеированных эритроцитов ставит перед нами методологические задачи, такие как сохранение динамических изменений острых стимулов для последующей оценки. Представленный протокол описывает методы пробоподготовки и окрашивания, которые позволяют сохранять и анализировать соответствующие изменения белка и последующее обнаружение.
Abstract
Мечение антителами белков эритроцитов (эритроцитов) является широко используемым полуколичественным методом для обнаружения изменений в общем содержании белка или острых изменений в состояниях активации белка. Это облегчает оценку лечения эритроцитами, характеристику различий в определенных состояниях заболевания и описание клеточной когерентности. Обнаружение остро измененной активации белка (например, посредством механотрансдукции) требует соответствующей подготовки образца для сохранения временных модификаций белка. Основной принцип включает в себя иммобилизацию сайтов-мишеней связывания желаемых белков эритроцитов для обеспечения первоначального связывания специфических первичных антител. Образец подвергается дальнейшей обработке, чтобы гарантировать оптимальные условия для связывания вторичного антитела с соответствующим первичным антителом. Выделение нефлуоресцентных вторичных антител требует дополнительной обработки, включающей сопряжение биотин-авидин и применение 3,3-диаминобензидин-тетрагидрохлорида (DAB) для развития окрашивания, которое необходимо контролировать в режиме реального времени под микроскопом, чтобы вовремя остановить окисление и, следовательно, интенсивность окрашивания. Для определения интенсивности окрашивания изображения делаются с помощью стандартного светового микроскопа. В модификации этого протокола вместо него может быть применено флуоресцеин-конъюгированное вторичное антитело, преимущество которого заключается в том, что нет необходимости в дальнейшем этапе разработки. Эта процедура, однако, требует флуоресцентного объектива, прикрепленного к микроскопу для обнаружения окрашивания. Учитывая полуколичественный характер этих методов, крайне важно обеспечить несколько контрольных красителей для учета неспецифических реакций антител и фоновых сигналов. Здесь мы представляем как протоколы окрашивания, так и соответствующие аналитические процессы, чтобы сравнить и обсудить соответствующие результаты и преимущества различных методов окрашивания.
Introduction
Эритроциты (эритроциты) проходят через сердечно-сосудистую систему в течение 70-140 дней, при этом средний возраст эритроцитов составляет примерно 115 дней1,2. Стареющие или поврежденные эритроциты удаляются из кровотока с помощью эритрофагоцитоза, эффективного процесса очистки, управляемого макрофагами3. Предопределенная продолжительность жизни этих клеток является одним из следствий отказа клеточных органелл, включая ядро, митохондрии и рибосомы, во время дифференцировки исозревания. Таким образом, циркулирующие эритроциты лишены трансляционного механизма, препятствующего синтезу новых белков3. Из этого следует, что динамические, посттрансляционные модификации существующих белков представляют собой единственный жизнеспособный механизм острой биохимической регуляции в ответ на внеклеточные и внутриклеточные стрессоры, действующие на эритроциты5.
Механические силы, по-видимому, являются основными внеклеточными сигналами, которые вызывают активацию или модуляцию биохимических путей в эритроцитах. Открытие механочувствительного белка Piezo1 в мембранах эритроцитов6 вдохновило несколько направлений исследований, изучающих механически активированную передачу сигналов в этих клетках7. Например, последние достижения показали, что физические свойства эритроцитов активно регулируются острыми и динамическими изменениями белков8, включая посттрансляционное фосфорилирование и убиквитинирование9. Поскольку эти нормальные модификации различаются при определенных заболеваниях 9,10,11, представляется научным и клиническим интересом определение состояния активации белков эритроцитов, особенно в отношении механобиологических процессов.
Определение острых изменений состояний активации белка эритроцитов ставит ряд методологических задач. Например, хранение образцов эритроцитов для последующего анализа требует сохранения модифицированных белков эритроцитов, так как посттрансляционные модификации недолговечны. Более того, классические методы обнаружения белка (например, вестерн-блоттинг), как известно, трудно стандартизировать в эритроцитах из-за низкого содержания белков по отношению к гемоглобину, на долю которого приходится ~98% содержания белка в этих клетках12. Таким образом, окрашивание химически консервированных эритроцитов на основе антител является методом выбора при исследовании острых модификаций важных белков эритроцитов, таких как эритро-специфическая изоформа синтазы оксида азота (RBC-NOS)13,14. Было показано, что RBC-NOS ферментативно продуцирует оксид азота (NO), который, по-видимому, необходим для основных свойств эритроцитов, включая деформируемость эритроцитов15,16,17. Посттрансляционные модификации RBC-NOS регулируют каталитическую активность фермента, при этом фосфорилирование остатка серина 1177 описано для увеличения активности фермента, в то время как фосфорилирование остатков серина 114 или треонина 495 было связано со снижением активности RBC-NOS18,19.
В совокупности временные модификации белков эритроцитов вносят свой вклад в важную клеточную функцию, и стандартизированные протоколы, позволяющие обнаруживать эти модифицированные белки, имеют высокую ценность. В этой статье мы представим два различных протокола, которые используют специфические антитела для облегчения обнаружения активации белка RBC-NOS, и обсудим рекомендации по анализу и интерпретации данных.
Эффективность описанных протоколов оценивалась путем измерения хорошо зарегистрированного увеличения фосфорилирования RBC-NOS в остатке серина 1177 в ответ на механические силы, отражающие те, которые происходят в сосудистой сети человека (5 Па).
Protocol
Representative Results
Discussion
В современной литературе высказывается предположение, что белок RBC-NOS имеет решающее значение для регуляции деформируемости эритроцитов 15,22,23, что, в свою очередь, облегчает их прохождение через узкие капилляры 24. Активнос…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LK выражает признательность за поддержку стипендии Австралийской государственной программы подготовки научных кадров.
Materials
| 3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate | Sigma/Merck | D5637 | DAB |
| Ammoniumchloride | Merck /Millipore | 101145 | NH4Cl |
| Centrifuge 5427 R | Eppendorf | 5409000010 | |
| Coverslips | VWR | 631-0147 | |
| di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate | Merck /Millipore | 106580 | Na2HPO4. 2 H2O |
| Disposable transfer pipettes | VWR | 612-6803 | |
| Entellan | Merck /Millipore | 107961 | rapid mounting medium for microscopy |
| Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK) | Hofmann | 642 | |
| Glucose-Oxidase | Sigma/Merck | G2133 | |
| Grease pencil | Dako | S 2002 | |
| Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase | Sigma/Merck | E-2886 | HRP |
| Hydrochloric acid | Merck /Millipore | 109057 | HCl |
| Hydrogen peroxide, 30% | Merck /Millipore | 107203 | H2O2 |
| ImageJ Software | Freeware | ||
| Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA) | RR Mechatronics | Ektacytometer instrument used for shearing | |
| Methanol | Merck /Millipore | 106009 | |
| Microscope slides | VWR | 630-1985 | |
| Nickel(II)-sulfate Hexahydrate | Sigma/Merck | N4882 | NiSO4.6H2O |
| Normal Goat serum | Agilent/DAKO | X0907 | NGS |
| Paraformaldehyde | Merck /Millipore | 818715 | PFA |
| Pipettes Eppendorf Reference 2 | VWR | 613-5836/ 613-5839 | |
| Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177) | Merck/Millipore | 07-428-I | Primary Antibody |
| Reaction tubes, 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
| Secondary Antibody goat anti rabbit | Agilent/DAKO | E0432 | Secondary Antibody |
| Skim milk powder | Bio-Rad | 170-6404 | |
| Sodium chloride | Merck /Millipore | 106404 | NaCl |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck /Millipore | 106346 | NaH2PO4.H2O |
| Sodium hydroxide, 1 M | Merck /Millipore | 150706 | NaOH |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Merck /Millipore | 108382 | Tris |
| Trypsin | Sigma/Merck | T7409 | |
| Tween20 | Merck /Millipore | 822184 | |
| Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F | Merck /Millipore | WHA1825047 | |
| Xylol | VWR Chemicals | 2,89,73,465 | |
| ß-D-Glucose monohydrate | Merck /Millipore | 14431-43-7 |
References
- Cohen, R. M., et al. Red cell life span heterogeneity in hematologically normal people is sufficient to alter HbA1c. Blood. 112 (10), 4284-4291 (2008).
- Mock, D. M., et al. Red blood cell (RBC) survival determined in humans using RBCs labeled at multiple biotin densities. Transfusion. 51 (5), 1047-1057 (2011).
- Thiagarajan, P., Parker, C. J., Prchal, J. T. How do red blood cells die?. Frontiers in Physiology. 12, 655393 (2021).
- Moras, M., Lefevre, S. D., Ostuni, M. A. From erythroblasts to mature red blood cells: organelle clearance in mammals. Frontiers in Physiology. 8, 1076 (2017).
- Pretini, V., et al. Red blood cells: chasing interactions. Frontiers in Physiology. 10, 945 (2019).
- Cahalan, S. M., et al. Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume. eLife. 4, e07370 (2015).
- Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Piezo1 regulates shear-dependent nitric oxide production in human erythrocytes. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 323 (1), H24-H37 (2022).
- Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Active modulation of human erythrocyte mechanics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (2), C250-C257 (2020).
- Strader, M. B., et al. Post-translational modification as a response to cellular stress induced by hemoglobin oxidation in sickle cell disease. Scientific Reports. 10 (1), 14218 (2020).
- Pecankova, K., Majek, P., Cermak, J., Dyr, J. E. Posttranslational modifications of red blood cell ghost proteins as "signatures" for distinguishing between low- and high-risk myelodysplastic syndrome patients. Turkish Journal of Haematology. 34 (1), 111-113 (2017).
- Grau, M., et al. High red blood cell nitric oxide synthase activation is not associated with improved vascular function and red blood cell deformability in sickle cell anaemia. British Journal of Haematology. 168 (5), 728-736 (2015).
- Sae-Lee, W., et al. The protein organization of a red blood cell. Cell Reports. 40 (3), 111103 (2022).
- Suhr, F., et al. Moderate exercise promotes human RBC-NOS activity, NO production and deformability through Akt kinase pathway. PLoS One. 7 (9), e45982 (2012).
- Kuck, L., Grau, M., Bloch, W., Simmonds, M. J. Shear stress ameliorates superoxide impairment to erythrocyte deformability with concurrent nitric oxide synthase activation. Frontiers in Physiology. 10, 36 (2019).
- Grau, M., et al. RBC-NOS-dependent S-nitrosylation of cytoskeletal proteins improves RBC deformability. PLoS One. 8 (2), e56759 (2013).
- Simmonds, M. J., Detterich, J. A., Connes, P. Nitric oxide, vasodilation and the red blood cell. Biorheology. 51 (2-3), 121-134 (2014).
- Bor-Kucukatay, M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Effects of nitric oxide on red blood cell deformability. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 284 (5), H1577-H1584 (2003).
- Suhr, F., et al. Intensive exercise induces changes of endothelial nitric oxide synthase pattern in human erythrocytes. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 20 (2), 95-103 (2009).
- Grau, M., et al. Regulation of red blood cell deformability is independent of red blood cell-nitric oxide synthase under hypoxia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 63 (3), 199-215 (2016).
- Grau, M., Kuck, L., Dietz, T., Bloch, W., Simmonds, M. J. Sub-fractions of red blood cells respond differently to shear exposure following superoxide treatment. Biologie. 10 (1), 47 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ozüyaman, B., Grau, M., Kelm, M., Merx, M. W., Kleinbongard, P. RBC NOS: regulatory mechanisms and therapeutic aspects. Trends in Molecular Medicine. 14 (7), 314-322 (2008).
- Kleinbongard, P., et al. Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase. Blood. 107 (7), 2943-2951 (2006).
- McMahon, T. J. Red blood cell deformability, vasoactive mediators, and adhesion. Frontiers in Physiology. 10, 1417 (2019).
- Bizjak, D. A., Brinkmann, C., Bloch, W., Grau, M. Increase in red blood cell-nitric oxide synthase dependent nitric oxide production during red blood cell aging in health and disease: a study on age dependent changes of rheologic and enzymatic properties in red blood cells. PLoS One. 10 (4), 0125206 (2015).
- Di Pietro, N., et al. Nitric oxide synthetic pathway and cGMP levels are altered in red blood cells from end-stage renal disease patients. Molecular and Cellular Biochemistry. 417 (1-2), 155-167 (2016).
- Grau, M., et al. Even patients with mild COVID-19 symptoms after SARS-CoV-2 infection show prolonged altered red blood cell morphology and rheological parameters. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 26 (10), 3022-3030 (2022).
- Mozar, A., et al. Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).
- Ulker, P., Gunduz, F., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Nitric oxide generated by red blood cells following exposure to shear stress dilates isolated small mesenteric arteries under hypoxic conditions. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 54 (4), 357-369 (2013).
- Nader, E., et al. Hydroxyurea therapy modulates sickle cell anemia red blood cell physiology: Impact on RBC deformability, oxidative stress, nitrite levels and nitric oxide synthase signalling pathway. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 81, 28-35 (2018).
- Fischer, U. M., Schindler, R., Brixius, K., Mehlhorn, U., Bloch, W. Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes. The Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 2000-2003 (2007).
- Horobin, J. T., Sabapathy, S., Kuck, L., Simmonds, M. J. Shear stress and RBC-NOS Serine1177 Phosphorylation in humans: a dose response. Life. 11 (1), 36 (2021).
- Kuck, L., Grau, M., Simmonds, M. J. Recovery time course of erythrocyte deformability following exposure to shear is dependent upon conditioning shear stress. Biorheology. 54 (5-6), 141-152 (2018).
- Grau, M., et al. Effect of acute exercise on RBC deformability and RBC nitric oxide synthase signalling pathway in young sickle cell anaemia patients. Scientific Reports. 9 (1), 11813 (2019).
- Feelisch, M. . Methods in Nitric Oxide Research. , (1998).
- Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood>. 120 (20), 4229-4237 (2012).
