Immunfärgningsbaserad detektion av dynamiska förändringar i röda blodkroppsproteiner
Summary
Att fånga dynamiska förändringar i proteinaktiveringen av enukleerade röda blodkroppar innebär metodologiska utmaningar, som bevarande av dynamiska förändringar i akuta stimuli för senare bedömning. Det presenterade protokollet beskriver provberednings- och färgningstekniker som möjliggör bevarande och analys av relevanta proteinförändringar och efterföljande detektion.
Abstract
Antikroppsmärkning av röda blodkroppar (RBC) proteiner är en vanligt använd, semikvantitativ metod för att upptäcka förändringar i det totala proteininnehållet eller akuta förändringar i proteinaktiveringstillstånd. Det underlättar bedömningen av RBC-behandlingar, karakterisering av skillnader i vissa sjukdomstillstånd och beskrivning av cellulära koherencies. Detektion av akut förändrad proteinaktivering (t.ex. genom mekanotransduktion) kräver adekvat provberedning för att bevara annars tillfälliga proteinmodifieringar. Grundprincipen innefattar immobilisering av målbindningsställena för de önskade RBC-proteinerna för att möjliggöra initial bindning av specifika primära antikroppar. Provet bearbetas vidare för att garantera optimala förhållanden för bindning av den sekundära antikroppen till motsvarande primära antikropp. Valet av icke-fluorescerande sekundära antikroppar kräver ytterligare behandling, inklusive koppling av biotin-avidin och applicering av 3,3-diaminobensidintetrahydroklorid (DAB) för att utveckla färgningen, som måste kontrolleras i realtid under ett mikroskop för att stoppa oxidationen och därmed färgningsintensiteten i tid. För färgningsintensitetsdetektering tas bilder med ett vanligt ljusmikroskop. Vid en modifiering av detta protokoll kan en fluoresceinkonjugerad sekundär antikropp appliceras istället, vilket har fördelen att inget ytterligare utvecklingssteg är nödvändigt. Denna procedur kräver emellertid ett fluorescensmål fäst vid ett mikroskop för färgningsdetektering. Med tanke på dessa metoders semikvantitativa karaktär är det absolut nödvändigt att tillhandahålla flera kontrollfläckar för att ta hänsyn till icke-specifika antikroppsreaktioner och bakgrundssignaler. Här presenterar vi både färgningsprotokoll och motsvarande analytiska processer för att jämföra och diskutera respektive resultat och fördelar med de olika färgningsteknikerna.
Introduction
Röda blodkroppar (RBC) passerar hjärt-kärlsystemet i 70 till 140 dagar, med en genomsnittlig RBC-ålder på cirka 115 dagar 1,2. Senescenta eller skadade röda blodkroppar avlägsnas från cirkulationen genom erytrofagocytos, en effektiv clearingprocess som drivs av makrofager3. Den förutbestämda livslängden för dessa celler är en konsekvens av att cellorganellerna överlämnas, inklusive kärnan, mitokondrierna och ribosomerna, under differentiering och mognad4. Således saknar cirkulerande RBC ett translationellt maskineri, vilket utesluter syntesen av nya proteiner3. Det följer att dynamiska, posttranslationella modifieringar av befintliga proteiner representerar den enda livskraftiga mekanismen för akut, biokemisk reglering som svar på extracellulära och intracellulära stressfaktorer som verkar på RBC5.
Mekaniska krafter verkar vara de viktigaste extracellulära signalerna som orsakar aktivering eller modulering av biokemiska vägar inom RBC. Upptäckten av det mekanokänsliga proteinet, Piezo1, i RBC-membran6 inspirerade flera forskningslinjer som undersökte mekaniskt aktiverad signalering i dessa celler7. Till exempel har de senaste framstegen visat att de fysikaliska egenskaperna hos RBC aktivt regleras av akuta och dynamiska förändringar av proteiner8, vilket inkluderar posttranslationell fosforylering och ubiquitinering9. Eftersom dessa normala modifieringar skiljer sig åt i vissa sjukdomar 9,10,11, verkar det vara av vetenskapligt och kliniskt intresse att bestämma aktiveringstillståndet för RBC-proteiner, särskilt i förhållande till mekanobiologiska processer.
Bestämningen av akuta förändringar i RBC-proteinaktiveringstillstånd innebär vissa metodologiska utmaningar. Till exempel kräver lagring av RBC-prover för senare analys bevarande av de modifierade RBC-proteinerna, eftersom posttranslationella modifieringar inte är hållbara. Dessutom är klassiska proteindetekteringsmetoder (t.ex. western blotting) notoriskt svåra att standardisera i RBC på grund av det låga överflödet av proteiner i förhållande till hemoglobin, vilket står för ~ 98% av proteininnehållet i dessa celler12. Således har antikroppsbaserad färgning av kemiskt bevarade röda blodkroppar varit den valda metoden vid undersökning av akuta modifieringar av viktiga RBC-proteiner, såsom den RBC-specifika isoformen av kväveoxidsyntas (RBC-NOS)13,14. RBC-NOS har visat sig enzymatiskt producera kväveoxid (NO), vilket verkar oumbärligt för väsentliga RBC-egenskaper, inklusive RBC-deformerbarhet15,16,17. Posttranslationella modifieringar av RBC-NOS reglerar katalytisk enzymaktivitet, där fosforylering av serin 1177-återstoden beskrivs för att öka enzymaktiviteten, medan fosforylering av resterna serin 114 eller treonin 495 har kopplats till minskad RBC-NOS-aktivitet18,19.
Sammantaget bidrar tillfälliga modifieringar av RBC-proteiner till viktig cellulär funktion, och standardiserade protokoll som möjliggör detektion av dessa modifierade proteiner är av högt värde. Här presenterar vi två distinkta protokoll som utnyttjar specifika antikroppar för att underlätta detektion av RBC-NOS-proteinaktivering och diskuterar rekommendationer för dataanalys och tolkning.
Prestanda för de beskrivna protokollen bedömdes genom mätning av den välrapporterade ökningen av fosforyleringen av RBC-NOS vid serin 1177-återstoden som svar på mekaniska krafter som återspeglar de som förekommer i den humana vaskulaturen (5 Pa).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ny litteratur tyder starkt på att RBC-NOS-proteinet är av avgörande betydelse för regleringen av RBC-deformerbarhet 15,22,23, vilket i sin tur underlättar deras passage genom smala kapillärer 24. Proteinaktiviteten beror i hög grad på posttranslationella proteinmodifieringar, särskilt fosforylering av vissa rester18. Fokus ligger på fosforyleringsstället 1177, som relat…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LK erkänner stödet från ett stipendium från Australian Government Research Training Program.
Materials
| 3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate | Sigma/Merck | D5637 | DAB |
| Ammoniumchloride | Merck /Millipore | 101145 | NH4Cl |
| Centrifuge 5427 R | Eppendorf | 5409000010 | |
| Coverslips | VWR | 631-0147 | |
| di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate | Merck /Millipore | 106580 | Na2HPO4. 2 H2O |
| Disposable transfer pipettes | VWR | 612-6803 | |
| Entellan | Merck /Millipore | 107961 | rapid mounting medium for microscopy |
| Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK) | Hofmann | 642 | |
| Glucose-Oxidase | Sigma/Merck | G2133 | |
| Grease pencil | Dako | S 2002 | |
| Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase | Sigma/Merck | E-2886 | HRP |
| Hydrochloric acid | Merck /Millipore | 109057 | HCl |
| Hydrogen peroxide, 30% | Merck /Millipore | 107203 | H2O2 |
| ImageJ Software | Freeware | ||
| Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA) | RR Mechatronics | Ektacytometer instrument used for shearing | |
| Methanol | Merck /Millipore | 106009 | |
| Microscope slides | VWR | 630-1985 | |
| Nickel(II)-sulfate Hexahydrate | Sigma/Merck | N4882 | NiSO4.6H2O |
| Normal Goat serum | Agilent/DAKO | X0907 | NGS |
| Paraformaldehyde | Merck /Millipore | 818715 | PFA |
| Pipettes Eppendorf Reference 2 | VWR | 613-5836/ 613-5839 | |
| Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177) | Merck/Millipore | 07-428-I | Primary Antibody |
| Reaction tubes, 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
| Secondary Antibody goat anti rabbit | Agilent/DAKO | E0432 | Secondary Antibody |
| Skim milk powder | Bio-Rad | 170-6404 | |
| Sodium chloride | Merck /Millipore | 106404 | NaCl |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck /Millipore | 106346 | NaH2PO4.H2O |
| Sodium hydroxide, 1 M | Merck /Millipore | 150706 | NaOH |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Merck /Millipore | 108382 | Tris |
| Trypsin | Sigma/Merck | T7409 | |
| Tween20 | Merck /Millipore | 822184 | |
| Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F | Merck /Millipore | WHA1825047 | |
| Xylol | VWR Chemicals | 2,89,73,465 | |
| ß-D-Glucose monohydrate | Merck /Millipore | 14431-43-7 |
References
- Cohen, R. M., et al. Red cell life span heterogeneity in hematologically normal people is sufficient to alter HbA1c. Blood. 112 (10), 4284-4291 (2008).
- Mock, D. M., et al. Red blood cell (RBC) survival determined in humans using RBCs labeled at multiple biotin densities. Transfusion. 51 (5), 1047-1057 (2011).
- Thiagarajan, P., Parker, C. J., Prchal, J. T. How do red blood cells die?. Frontiers in Physiology. 12, 655393 (2021).
- Moras, M., Lefevre, S. D., Ostuni, M. A. From erythroblasts to mature red blood cells: organelle clearance in mammals. Frontiers in Physiology. 8, 1076 (2017).
- Pretini, V., et al. Red blood cells: chasing interactions. Frontiers in Physiology. 10, 945 (2019).
- Cahalan, S. M., et al. Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume. eLife. 4, e07370 (2015).
- Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Piezo1 regulates shear-dependent nitric oxide production in human erythrocytes. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 323 (1), H24-H37 (2022).
- Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Active modulation of human erythrocyte mechanics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (2), C250-C257 (2020).
- Strader, M. B., et al. Post-translational modification as a response to cellular stress induced by hemoglobin oxidation in sickle cell disease. Scientific Reports. 10 (1), 14218 (2020).
- Pecankova, K., Majek, P., Cermak, J., Dyr, J. E. Posttranslational modifications of red blood cell ghost proteins as "signatures" for distinguishing between low- and high-risk myelodysplastic syndrome patients. Turkish Journal of Haematology. 34 (1), 111-113 (2017).
- Grau, M., et al. High red blood cell nitric oxide synthase activation is not associated with improved vascular function and red blood cell deformability in sickle cell anaemia. British Journal of Haematology. 168 (5), 728-736 (2015).
- Sae-Lee, W., et al. The protein organization of a red blood cell. Cell Reports. 40 (3), 111103 (2022).
- Suhr, F., et al. Moderate exercise promotes human RBC-NOS activity, NO production and deformability through Akt kinase pathway. PLoS One. 7 (9), e45982 (2012).
- Kuck, L., Grau, M., Bloch, W., Simmonds, M. J. Shear stress ameliorates superoxide impairment to erythrocyte deformability with concurrent nitric oxide synthase activation. Frontiers in Physiology. 10, 36 (2019).
- Grau, M., et al. RBC-NOS-dependent S-nitrosylation of cytoskeletal proteins improves RBC deformability. PLoS One. 8 (2), e56759 (2013).
- Simmonds, M. J., Detterich, J. A., Connes, P. Nitric oxide, vasodilation and the red blood cell. Biorheology. 51 (2-3), 121-134 (2014).
- Bor-Kucukatay, M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Effects of nitric oxide on red blood cell deformability. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 284 (5), H1577-H1584 (2003).
- Suhr, F., et al. Intensive exercise induces changes of endothelial nitric oxide synthase pattern in human erythrocytes. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 20 (2), 95-103 (2009).
- Grau, M., et al. Regulation of red blood cell deformability is independent of red blood cell-nitric oxide synthase under hypoxia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 63 (3), 199-215 (2016).
- Grau, M., Kuck, L., Dietz, T., Bloch, W., Simmonds, M. J. Sub-fractions of red blood cells respond differently to shear exposure following superoxide treatment. Biologie. 10 (1), 47 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ozüyaman, B., Grau, M., Kelm, M., Merx, M. W., Kleinbongard, P. RBC NOS: regulatory mechanisms and therapeutic aspects. Trends in Molecular Medicine. 14 (7), 314-322 (2008).
- Kleinbongard, P., et al. Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase. Blood. 107 (7), 2943-2951 (2006).
- McMahon, T. J. Red blood cell deformability, vasoactive mediators, and adhesion. Frontiers in Physiology. 10, 1417 (2019).
- Bizjak, D. A., Brinkmann, C., Bloch, W., Grau, M. Increase in red blood cell-nitric oxide synthase dependent nitric oxide production during red blood cell aging in health and disease: a study on age dependent changes of rheologic and enzymatic properties in red blood cells. PLoS One. 10 (4), 0125206 (2015).
- Di Pietro, N., et al. Nitric oxide synthetic pathway and cGMP levels are altered in red blood cells from end-stage renal disease patients. Molecular and Cellular Biochemistry. 417 (1-2), 155-167 (2016).
- Grau, M., et al. Even patients with mild COVID-19 symptoms after SARS-CoV-2 infection show prolonged altered red blood cell morphology and rheological parameters. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 26 (10), 3022-3030 (2022).
- Mozar, A., et al. Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).
- Ulker, P., Gunduz, F., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Nitric oxide generated by red blood cells following exposure to shear stress dilates isolated small mesenteric arteries under hypoxic conditions. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 54 (4), 357-369 (2013).
- Nader, E., et al. Hydroxyurea therapy modulates sickle cell anemia red blood cell physiology: Impact on RBC deformability, oxidative stress, nitrite levels and nitric oxide synthase signalling pathway. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 81, 28-35 (2018).
- Fischer, U. M., Schindler, R., Brixius, K., Mehlhorn, U., Bloch, W. Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes. The Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 2000-2003 (2007).
- Horobin, J. T., Sabapathy, S., Kuck, L., Simmonds, M. J. Shear stress and RBC-NOS Serine1177 Phosphorylation in humans: a dose response. Life. 11 (1), 36 (2021).
- Kuck, L., Grau, M., Simmonds, M. J. Recovery time course of erythrocyte deformability following exposure to shear is dependent upon conditioning shear stress. Biorheology. 54 (5-6), 141-152 (2018).
- Grau, M., et al. Effect of acute exercise on RBC deformability and RBC nitric oxide synthase signalling pathway in young sickle cell anaemia patients. Scientific Reports. 9 (1), 11813 (2019).
- Feelisch, M. . Methods in Nitric Oxide Research. , (1998).
- Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood>. 120 (20), 4229-4237 (2012).
