Her demonstrerer vi en ikke-invasiv kontraktilitetsevalueringsmetode for hjertemedicinsk udstyr ved hjælp af 2D humant induceret pluripotent stamcelleafledt kardiomyocyt (hiPSC-CM) monolag, belagt på et fleksibelt substrat kombineret med videobaseret mikroskopi. Dette værktøj vil være nyttigt til in vitro-evaluering af kontraktile egenskaber af hjerteelektrofysiologiske enheder.
Human inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM’er) undersøges i øjeblikket til flere in vitro-applikationer og er blevet anvendt i regulatoriske indsendelser. Her udvider vi deres anvendelse til hjertemedicinsk udstyrs sikkerhed eller ydeevnevurderinger. Vi udviklede en ny metode til evaluering af kontraktile egenskaber for hjertemedicinsk udstyr i robust sammentrækkende 2D hiPSC-CMs monolag belagt på et fleksibelt ekstracellulært matrix (ECM) -baseret hydrogelsubstrat. Dette værktøj muliggør kvantificering af virkningerne af hjerteelektrofysiologiske enhedssignaler på menneskelig hjertefunktion (f.eks. kontraktile egenskaber) med standard laboratorieudstyr. 2D hiPSC-CM-monolagene blev dyrket i 2-4 dage på et fleksibelt hydrogelsubstrat i et 48-brønds format.
hiPSC-CM’erne blev udsat for standard hjertekontraktilitetsmodulation (CCM) elektriske signaler til medicinsk udstyr og sammenlignet med kontrol (dvs. kun pacing) hiPSC-CM’er. De grundlæggende kontraktile egenskaber for 2D hiPSC-CM’erne blev kvantificeret ved videobaseret detektionsanalyse baseret på pixelforskydning. De CCM-stimulerede 2D hiPSC-CM’er belagt på det fleksible hydrogelsubstrat viste signifikant forbedrede kontraktile egenskaber i forhold til baseline (dvs. før CCM-stimulering), herunder en øget peak kontraktionsamplitude og accelereret sammentræknings- og afslapningskinetik. Desuden muliggør udnyttelsen af det fleksible hydrogelsubstrat multiplexing af de videobaserede kardiokalitationskontraktionskoblingsaflæsninger (dvs. elektrofysiologi, calciumhåndtering og sammentrækning) i raske og syge hiPSC-CM’er. Den nøjagtige detektion og kvantificering af virkningerne af hjerteelektrofysiologiske signaler på menneskelig hjertesammentrækning er afgørende for udvikling, optimering og de-risiko for hjertemedicinsk udstyr. Denne metode muliggør robust visualisering og kvantificering af de kontraktile egenskaber af hjertesyncytium, hvilket bør være værdifuldt for ikke-klinisk hjertemedicinsk udstyrs sikkerhed eller effektivitetstest. Dette papir beskriver detaljeret metoden til generering af 2D hiPSC-CM hydrogel substratmonolag.
Efterhånden som den amerikanske befolkning bliver ældre, fortsætter antallet af patienter med hjertesvigt med at stige sammen med de direkte medicinske omkostninger 1,2. Der er et kritisk behov for at udvikle nye terapier til behandling af hjertesvigt og innovative ikke-kliniske metoder til at teste sådanne terapier. Human inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM’er) er blevet foreslået som et in vitro-værktøj til støtte for den terapeutiske udviklingsproces og er blevet anvendt i regulatoriske indlæg 3,4. Deres udbredte anvendelse har imidlertid været begrænset til kontraktilitetsundersøgelser på grund af manglen på robuste kontraktile egenskaber, når de belægges under standard stive 2D-kulturbetingelser (dvs. konventionel vævskulturplast eller glas)5,6,7,8. Vi har tidligere demonstreret nytten af plettering af isolerede enkelte hiPSC-CM’er på et fleksibelt hydrogelsubstrat for at generere robuste synlige kontraktile egenskaber9. Vi viste, at isolerede hiPSC-CM’er har sammenlignelige kontraktile egenskaber med dem hos nyligt isolerede voksne ventrikulære kardiomyocytter hos voksne. Desuden demonstrerede vi nytten af denne metode til vurdering af kontraktile responser på farmakologiske midler7. Desuden har andre undersøgelser anvendt denne teknologi til mekanistiske vurderinger til grundvidenskab og sygdomsmodellering10,11,12. Her er denne metode blevet udvidet til 2D hiPSC-CM monolag, og dens anvendelighed til evaluering af fysiologisk relevante elektriske signaler om hjertekontraktilitetsmodulation (CCM) medicinsk udstyr in vitro demonstreres.
CCM er en intrakardial hjertesvigtsbehandling, hvor ikke-excitatoriske elektrofysiologiske signaler leveres til myokardiet i den absolutte ildfaste periode af hjertecyklussen13,14. Der mangler reproducerbare metoder til evaluering af CCM i humane hjertecellemodeller. Tidligere arbejde har anvendt forskellige hjertecellemodeller til at evaluere CCM-kontraktilresponsen. Vi demonstrerede in vitro, at nyligt isolerede kaninventrikulære kardiomyocytter reagerer på CCM-stimulering ved en forbigående stigning i calcium og sammentrækningsamplitude15. En anden undersøgelse af isolerede ventrikulære kardiomyocytter hos hunde viste CCM-induceret forbedring af den intracellulære calciumtransiente amplitude16. I de fleste CCM-undersøgelser er der imidlertid anvendt ex vivo- og in vivo-præparater til dyr. Disse undersøgelser er vanskelige at korrelere med hinanden, fordi de anvender en række CCM-pulsparametre og arter17. En undersøgelse i en isoleret kaninpapillær model afslørede øget CCM-induceret kontraktilitet8,18, og en række helhjerteundersøgelser har vist CCM-induceret forbedring af kontraktil funktion19,20,21. Disse undersøgelser har givet vigtig mekanistisk indsigt. Der mangler imidlertid reproducerbare humane modeller for in vitro kardiale EP-kontraktile studier, herunder CCM. Til det formål har vi udviklet flere 2D- og 3D hiPSC-modeller og demonstreret CCM-induceret forbedring af kontraktile egenskaber på en parameterafhængig måde. Desuden har de CCM-inducerede inotrope virkninger vist sig at være delvist medieret af neuronal input og β-adrenerg signalering 8,17,22. Alligevel skal der vides mere om mekanismerne i CCM-terapi, og udnyttelse af kontraherende humane kardiomyocytter kan hjælpe med at opnå dette resultat. Som sådan er der et betydeligt behov for at udvikle humane ikke-kliniske værktøjer til evaluering af nye CCM-enheder og -signaler, fremskynde reguleringsprocessen, reducere byrden på dyremodeller og hjælpe enhedsudvikleremed at træffe beslutninger 8,17,23,24. Det er vigtigt at udvikle nemme, gør-det-selv-protokoller, der kan overføres til ethvert laboratorium, og som bruger standardudstyr og lave cellekrav for at reducere omkostningerne. Denne metode belyser virkningerne af CCM-stimulering på human kardiomyocytfunktion og giver vigtig indsigt i CCM-sikkerhed eller effektivitet17. Her beskriver vi metoden til generering af 2D hiPSC-CM-monolag på et fleksibelt hydrogelsubstrat for at producere et standardiseret ikke-klinisk værktøj til kvantificering af akut hjerteelektrofysiologi medicinsk udstyr (dvs. CCM) kontraktile reaktioner i sundhed og sygdom.
Protokollen skitseret heri beskriver en metode til at generere robust sammentrækkende 2D hiPSC-CM-monolag på et fleksibelt ekstracellulært matrix (ECM)-baseret hydrogelsubstrat med kommercielle reagenser 7,17. HiPSC-CM’erne, der er podet på det fleksible hydrogelsubstrat, forbliver levedygtige og har forbedrede kontraktile egenskaber7. Denne teknik er afhængig af standard laboratorieudstyr ogkapaciteter 7. Der er flere kritiske trin i protokollen, herunder i forhold til at arbejde med det ECM-baserede hydrogelsubstrat, der kræver omhyggelig opmærksomhed på detaljer. Et potentielt problem er tilstedeværelsen af serum i mediet. Dette kan resultere i, at hiPSC-CM’erne danner netværk (f.eks. endotel/vaskulære netværk) i stedet for et sammenflydende enkeltlagsark; derfor anbefales et serumfrit medium under etableringen af de fleksible hydrogel hiPSC-CM-monolag (dvs. dag 0 til dag 4). På samme måde kan forberedelse af for mange hydrogelsubstrater ad gangen resultere i dårlige eller ujævne substrater på grund af operatørtræthed. Selvom det er vigtigt at arbejde hurtigt, er integriteten af hvert hydrogelsubstrat kritisk. På samme måde bør man omhyggeligt frø hiPSC-CM’erne og ændre mediet; Dette bør ikke gøres med magt. Når mediet ændres, skal det tilsættes forsigtigt fra brøndens øverste kant for ikke at forstyrre hydrogelsubstratet eller cellerne. Som med standard 2D hiPSC-CM-kulturer (dvs. konventionel vævskulturplast eller glas) vil plettering ved lav densitet resultere i ufuldstændig enkeltlagsdannelse. Det er vigtigt visuelt at inspicere hiPSC-CM’erne for at bekræfte, at de er på hydrogelsubstratet og bruge en timer for at sikre nøjagtig timing. Desuden kan dyrkning af 2D hiPSC-CM-monolagene i mere end 14 dage på hydrogelsubstratet resultere i monolagsforstyrrelser baseret på ECM-egenskaberne og instruktioner fra producenten af substratet.
Der er flere begrænsninger for den nuværende metode, der skal overvejes. For det første var cellerne, der blev brugt i denne protokol, fra en kommerciel hiPSC-CM-udbyder, og disse celler danner et syncytium af elektrisk koblede celler. Syncytium indeholder en blanding af hiPSC-CM’er fra alle tre hjerteundertyper (dvs. ventrikulære, atriale og nodale)17. Studier kan drage fordel af en subtype-eksklusiv hiPSC-CM-population (dvs. 100% ventrikulær eller 100% atriel). For det andet anvendte denne metode kun hiPSC-CM’er, mens ikke-myocytter, herunder hjertefibroblaster, endotelceller og neuroner, kan forbedre hiPSC-CM-funktionaliteten22,36. For det tredje viser 2D hiPSC-CM’er flere funktioner i relativt umodne kardiomyocytter, herunder spontan slag, amorf morfologi og mangel på et inotropt respons 8,37. For det fjerde, mens denne protokol producerer robust kontraherende 2D hiPSC-CM-monolag, er det sandsynligt, at funktionelt forbedrede 3D hiPSC-CM-modeller såsom konstruerede hjertevæv (ECT’er) vil resultere i et forbedret CCM-induceret kontraktilt respons under fysiologiske calciumkoncentrationer 8,38. Endelig er protokollen beskrevet her designet til et 48-brøndsformat. Men med optimering og inkludering af automatisering kan dette skaleres til et højt gennemløbsformat (f.eks. 96-brønds- eller 384-brøndplader).
Den nuværende guldstandard for hiPSC-CM-undersøgelser er konventionelle stive 2D-kulturbetingelser (dvs. vævskulturplast eller glas). Selvom den konventionelle metode er nyttig til elektrofysiologi3 og calciumhåndtering39 undersøgelser, resulterer den i minimale kontraktile egenskaber 5,6,7. Som følge heraf kan konventionelle stive 2D-kulturbetingelser ikke vurderes af CCM’s kontraktile virkninger8. Funktionelt forbedrede 3D hiPSC-CM ECT-metoder38 er teknisk udfordrende, tidskrævende og kræver sofistikeret udstyr, der ikke er let tilgængeligt i alle laboratorier. I denne protokol beskriver vi en simpel metode til at generere robust sammentrækkende 2D hiPSC-CM-monolag inden for en kortere tidsramme end 3D ECT-metoder eller langsigtede, konventionelle 2D-metoder 7,40,41. Desuden er de reagenser, der anvendes her, kommercielt tilgængelige, herunder hydrogelsubstratet og hiPSC-CM’erne, og begge har betydelig lot-to-lot konsistens. Mens vi brugte aftagelige platintrådelektroder (interelektrodeafstand: 2,0 mm, bredde: 1,0 mm), er forskellige elektrodematerialer og konfigurationer modtagelige for CCM-kontraktile vurderinger in vitro 8,15,17,18,22. Ligeledes er der flere automatiserede software til rådighed, der muliggør analyse af sammentrækningsvideoer 7,31,32.
De fleste ikke-kliniske metoder til evaluering af kontraktilitet i forbindelse med hjertemedicinsk udstyr er i vid udstrækning baseret på dyre in vivo-dyremodeller (f.eks. hunde eller svin) og teknisk udfordrende papillære muskelstrimler (f.eks. kaniner)18. Dette papir beskrev en human in vitro-model til evaluering af virkningerne af hjerteelektrofysiologi, medicinsk udstyrssignaler på kontraktilitet. Dette værktøj kan reducere afhængigheden af dyreforsøg og være nyttigt til in vitro-evaluering af de kontraktile egenskaber ved hjerteelektrofysiologiudstyr.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev delvist støttet af en udnævnelse til forskningsdeltagelsesprogrammet ved Center for Devices and Radiological Health administreret af Oak Ridge Institute for Science and Education gennem en interagency aftale mellem US Department of Energy og US Food and Drug Administration. Forfatterne takker Richard Gray, Trent Robertson og Anna Avila for deres forslag og tekniske assistance. Undersøgelsen blev finansieret gennem US Food and Drug Administration, Office of Science and Engineering Laboratories.
0.1% Gelatin | STEMCELL Technologies | 7903 | Pre-plating Culture Substrate |
48-well Plate | MatTek | P48G-1.5-6-F | Hydrogel Substrate hiPSC-CM Culture, Glass |
6-well Plate | Thermofisher | 140675 | hiPSC-CM Culture, Plastic |
B-27 Supplement, with insulin | Invitrogen | 17504-044 | Cardiomyocyte Media |
Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) | Fisher Scientific | c70-500 | Tyrode’s solution |
CellOPTIQ Platform and Software | Clyde Biosciences | Contraction Recording and Analysis | |
Conical tube 15 mL | Corning | 352099 | hiPSC-CM Dissociation |
Digital CMOS Camera | Hamamatsu | C11440-42U30 | Contraction Video Recording |
D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | Cell Wash |
Environmental Control Chamber | OKOLAB INC | H201-K-FRAME | Environmental Regulation |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1kg | Tyrode’s solution |
Hemocytometer | Fisher Scientific | 22-600-107 | hiPSC-CM Counting |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s solution |
iCell Cardiomyocytes Plating Medium | Fujifilm Cellular Dynamic, Inc. | M1001 | hiPSC-CM Plating Media |
iCell Cardiomyocytes2, 01434 | Fujifilm Cellular Dynamic, Inc. | R1017 | hiPSC-CMs |
Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermofisher | 50116047 | Maintain hiPSC-CMs |
Inverted Microscope | Olympus | IX73 | Imaging hiPSC-CMs |
Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2) | Fisher Scientific | m33-500 | Tyrode’s solution |
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356230 | Flexible Hydrogel Substrate |
Microcentrifuge tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | Hydrogel Substrate Aliquot |
Model 4100 Isolated High Power Stimulator | AM-Systems | Model 4100 | Pulse Generator |
MyCell Cardiomyocytes DCM LMNA L35P, 01016 | Fujifilm Cellular Dynamic, Inc. | R1153 | DCM hiPSC-CMs |
Pen-Strep | Invitrogen | 15140-122 | Cardiomyocyte Media |
Pipette L-20 | Rainin | 17014392 | Plating Hydrogel Substrate |
Pipette P1000 | Fisher Scientific | F123602G | |
Pipette tips, 1000 ul | Fisher Scientific | 02-707-509 | |
Pipette tips, 20 ul | Rainin | GPS-L10S | Making Hydrogel Substrate |
Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P330-500 | Tyrode’s solution |
RPMI 1640, with glucose | Invitrogen | 11875 | Cardiomyocyte Media |
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | s641-212 | Tyrode’s solution |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465 | Tyrode’s solution |
Stimulation Electrodes | Pacing and CCM Stimulation | ||
Stopwatch/Timer | Fisher Scientific | 02-261-840 | Plating Hydrogel Substrate |
Trypan Blue Stain | Life Technologies | T10282 | hiPSC-CM Counting |
TrypLE Express | Life Technologies | 12605-010 | hiPSC-CM Dissociation |