Här demonstrerar vi en icke-invasiv metod för utvärdering av kontraktilitet för hjärtmedicinsk utrustning med användning av 2D-humaninducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter (hiPSC-CM) monolager, pläterade på ett flexibelt substrat, i kombination med videobaserad mikroskopi. Detta verktyg kommer att vara användbart för in vitro-utvärdering av kontraktila egenskaper hos hjärtelektrofysiologiska enheter.
Humant inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter (hiPSC-CMs) undersöks för närvarande för flera in vitro-applikationer och har använts i regulatoriska ansökningar. Här utvidgar vi deras användning till säkerhets- eller prestandabedömningar av hjärtmedicinsk utrustning. Vi utvecklade en ny metod för att utvärdera kontraktila egenskaper hos hjärtmedicinsk utrustning i robust kontraherande 2D hiPSC-CMs monolager pläterade på ett flexibelt extracellulärt matris (ECM) -baserat hydrogelsubstrat. Detta verktyg möjliggör kvantifiering av effekterna av hjärtelektrofysiologiska enhetssignaler på mänsklig hjärtfunktion (t.ex. kontraktila egenskaper) med standardlaboratorieutrustning. 2D hiPSC-CM-monolagren odlades i 2-4 dagar på ett flexibelt hydrogelsubstrat i ett 48-brunnsformat.
hiPSC-CMs utsattes för standard hjärtkontraktilitetsmodulering (CCM) elektriska signaler för medicinsk utrustning och jämfördes med kontroll (dvs. endast pacing) hiPSC-CM. Baslinjens kontraktila egenskaper hos 2D hiPSC-CMs kvantifierades genom videobaserad detektionsanalys baserad på pixelförskjutning. De CCM-stimulerade 2D hiPSC-CMs pläterade på det flexibla hydrogelsubstratet visade signifikant förbättrade kontraktila egenskaper i förhållande till baslinjen (dvs. före CCM-stimulering), inklusive en ökad toppkontraktionsamplitud och accelererad kontraktion och avslappningskinetik. Dessutom möjliggör användningen av det flexibla hydrogelsubstratet multiplexering av de videobaserade avläsningarna av hjärt-excitationskontraktionskoppling (dvs. elektrofysiologi, kalciumhantering och sammandragning) i friska och sjuka hiPSC-CM. Noggrann detektion och kvantifiering av effekterna av hjärtelektrofysiologiska signaler på mänsklig hjärtkontraktion är avgörande för utveckling, optimering och riskreducering av hjärtmedicinsk utrustning. Denna metod möjliggör robust visualisering och kvantifiering av hjärtsyncytiums kontraktila egenskaper, vilket bör vara värdefullt för icke-klinisk säkerhets- eller effektivitetstestning av hjärtmedicinsk utrustning. Detta dokument beskriver i detalj metoden för att generera 2D hiPSC-CM hydrogelsubstratmonolager.
När USA: s befolkning åldras fortsätter antalet hjärtsviktpatienter att öka, tillsammans med de direkta medicinska kostnaderna 1,2. Det finns ett kritiskt behov av att utveckla nya terapier för att behandla hjärtsvikt och innovativa icke-kliniska metoder för att testa sådana terapier. Humant inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter (hiPSC-CMs) har föreslagits som ett in vitro-verktyg för att underlätta den terapeutiska utvecklingsprocessen och har använts i regulatoriska inlämningar 3,4. Deras utbredda användning har dock begränsats för kontraktilitetsstudier på grund av bristen på robusta kontraktila egenskaper när de pläteras under standardstyva 2D-odlingsförhållanden (dvs. konventionell vävnadsodlingsplast eller glas)5,6,7,8. Vi har tidigare demonstrerat nyttan av att plätera isolerade enskilda hiPSC-CMs på ett flexibelt hydrogelsubstrat för att generera robusta synliga kontraktila egenskaper9. Vi visade att isolerade hiPSC-CMs har jämförbara kontraktila egenskaper med de hos nyligen isolerade vuxna kaninventrikulära kardiomyocyter. Dessutom demonstrerade vi användbarheten av denna metod för att bedöma kontraktila svar på farmakologiska medel7. Dessutom har andra studier tillämpat denna teknik på mekanistiska bedömningar för grundvetenskap och sjukdomsmodellering10,11,12. Här har denna metod utvidgats till 2D hiPSC-CM-monolager, och dess användbarhet vid utvärdering av fysiologiskt relevanta elektriska signaler för hjärtkontraktilitet modulering (CCM) in vitro demonstreras.
CCM är en intrakardiell hjärtsviktsbehandling där icke-excitatoriska elektrofysiologiska signaler levereras till myokardiet under den absoluta eldfasta perioden av hjärtcykeln13,14. Reproducerbara metoder för att utvärdera CCM i humana hjärtcellsmodeller saknas. Tidigare arbete har använt olika hjärtcellsmodeller för att utvärdera CCM-kontraktilsvaret. Vi visade in vitro att nyisolerade kaninventrikulära kardiomyocyter svarar på CCM-stimulering genom en övergående ökning av kalcium och kontraktionsamplitud15. En annan studie på isolerade ventrikulära kardiomyocyter hos hundar visade CCM-inducerad förbättring av den intracellulära kalciumtransienta amplituden16. Majoriteten av CCM-studierna har dock använt ex vivo och in vivo djurpreparat. Dessa studier är svåra att korrelera med varandra eftersom de tillämpar en mängd olika CCM-pulsparametrar och arter17. En studie i en isolerad kaninpapillärmodell avslöjade ökad CCM-inducerad kontraktilitet8,18, och en rad helhjärtstudier har visat CCM-inducerad förbättring av kontraktil funktion19,20,21. Dessa studier har gett viktiga mekanistiska insikter. Det saknas dock reproducerbara humana modeller för in vitro hjärt-EP-kontraktila studier inklusive CCM. För detta ändamål har vi utvecklat flera 2D- och 3D-hiPSC-modeller och demonstrerat CCM-inducerad förbättring av kontraktila egenskaper på ett parameterberoende sätt. Dessutom har de CCM-inducerade inotropa effekterna visat sig delvis medieras av neuronal inmatning och β-adrenerg signalering 8,17,22. Ändå behöver mer vara känt om mekanismerna för CCM-terapi, och användning av kontraherande humana kardiomyocyter kan hjälpa till att uppnå detta resultat. Som sådan finns det ett betydande behov av att utveckla mänskliga icke-kliniska verktyg för att utvärdera nya CCM-enheter och signaler, påskynda regleringsprocessen, minska belastningen på djurmodeller och hjälpa enhetsutvecklare att fatta beslut 8,17,23,24. Det är viktigt att utveckla enkla, gör-det-själv-protokoll som kan överföras till vilket laboratorium som helst och som använder standardutrustning och låga cellkrav för att minska kostnaderna. Denna metod belyser effekterna av CCM-stimulering på human kardiomyocytfunktion och ger viktiga insikter om CCM-säkerhet eller effektivitet17. Här beskriver vi metoden för att generera 2D hiPSC-CM-monolager på ett flexibelt hydrogelsubstrat för att producera ett standardiserat icke-kliniskt verktyg för att kvantifiera akut hjärtelektrofysiologisk medicinsk utrustning (dvs. CCM) kontraktila svar i hälsa och sjukdom.
Protokollet som beskrivs här beskriver en metod för att generera robust kontraherande 2D hiPSC-CM-monolager på ett flexibelt extracellulärt matris (ECM)-baserat hydrogelsubstrat med kommersiella reagens 7,17. HiPSC-CMs sådda på det flexibla hydrogelsubstratet förblir livskraftiga och har förbättrade kontraktila egenskaper7. Denna teknik bygger på standardlaboratorieutrustning och kapacitet7. Det finns flera kritiska steg i protokollet, inklusive i förhållande till arbetet med det ECM-baserade hydrogelsubstratet, som kräver noggrann uppmärksamhet på detaljer. Ett potentiellt problem är närvaron av serum i mediet. Detta kan leda till att hiPSC-CM bildar nätverk (t.ex. endoteliala/vaskulära nätverk) istället för ett konfluent monolagerark; därför rekommenderas ett serumfritt medium vid upprättandet av de flexibla hydrogelmonolagren hiPSC-CM (dvs. dag 0 till dag 4). På samma sätt kan beredning av för många hydrogelsubstrat samtidigt resultera i dåliga eller ojämna substrat på grund av operatörströtthet. Även om det är viktigt att arbeta snabbt är integriteten hos varje hydrogelsubstrat kritisk. På samma sätt bör man noggrant fröa hiPSC-CM och byta medium; Detta bör inte göras kraftfullt. Vid byte av medium bör det tillsättas försiktigt från brunnens övre kant för att inte störa hydrogelsubstratet eller cellerna. Som med standard 2D hiPSC-CM-kulturer (dvs. konventionell vävnadsodlingsplast eller glas) kommer plätering med låg densitet att resultera i ofullständig enskiktsbildning. Det är viktigt att visuellt inspektera hiPSC-CM för att bekräfta att de finns på hydrogelsubstratet och att använda en timer för att säkerställa korrekt timing. Dessutom kan odling av 2D hiPSC-CM-monolager i mer än 14 dagar på hydrogelsubstratet resultera i enskiktsstörningar, baserat på ECM-egenskaperna och instruktionerna från tillverkaren av substratet.
Det finns flera begränsningar för den nuvarande metoden som måste beaktas. För det första var cellerna som användes i detta protokoll från en kommersiell hiPSC-CMs-leverantör, och dessa celler bildar ett syncytium av elektriskt kopplade celler. Synkytiet innehåller en blandning av hiPSC-CM från alla tre hjärtsubtyperna (dvs. ventrikulär, förmak och nodal)17. Studier kan dra nytta av en subtyp-exklusiv hiPSC-CM-population (dvs. 100% ventrikulär eller 100% förmak). För det andra använde denna metod endast hiPSC-CM, medan icke-myocyter, inklusive hjärtfibroblaster, endotelceller och neuroner, kan förbättra hiPSC-CM-funktionaliteten22,36. För det tredje visar 2D hiPSC-CMs flera egenskaper hos relativt omogna kardiomyocyter, inklusive spontan slagning, amorf morfologi och brist på inotropt svar 8,37. För det fjärde, medan detta protokoll producerar robust kontraherande 2D hiPSC-CM-monolager, är det troligt att funktionellt förbättrade 3D hiPSC-CM-modeller såsom konstruerade hjärtvävnader (ECT) kommer att resultera i ett förbättrat CCM-inducerat kontraktilt svar under fysiologiska kalciumkoncentrationer 8,38. Slutligen är protokollet som beskrivs här utformat för ett 48-brunnsformat. Men med optimering och inkludering av automatisering kan detta skalas till ett format med hög genomströmning (t.ex. plattor med 96 brunnar eller 384 brunnar).
Den nuvarande guldstandarden för hiPSC-CM-studier är konventionella styva 2D-odlingsförhållanden (dvs. vävnadsodlingsplast eller glas). Även om den konventionella metoden är användbar för elektrofysiologi3 och kalciumhantering39 studier, resulterar den i minimala kontraktila egenskaper 5,6,7. Som ett resultat är konventionella styva 2D-odlingsförhållanden inte mottagliga för bedömning av CCM-kontraktila effekter8. Funktionellt förbättrade 3D hiPSC-CM ECT-metoder38 är tekniskt utmanande, tidskrävande och kräver sofistikerad utrustning som inte är lätt tillgänglig i alla laboratorier. I detta protokoll beskriver vi en enkel metod för att generera robust kontrakterande 2D hiPSC-CM-monolager inom en kortare tidsram än 3D ECT-metoder eller långsiktiga, konventionella 2D-metoder 7,40,41. Dessutom är de reagens som används här kommersiellt tillgängliga, inklusive hydrogelsubstratet och hiPSC-CM, och båda har betydande parti-till-parti-konsistens. Medan vi använde avtagbara platinatrådelektroder (interelektrodavstånd: 2,0 mm, bredd: 1,0 mm), är olika elektrodmaterial och konfigurationer mottagliga för CCM-kontraktila bedömningar in vitro 8,15,17,18,22. På samma sätt finns det flera automatiserade program tillgängliga som möjliggör analys av sammandragningsvideor 7,31,32.
Majoriteten av icke-kliniska metoder för att utvärdera kontraktilitet för hjärtmedicinsk utrustning bygger till stor del på kostsamma in vivo-djurmodeller (t.ex. hundar eller grisar) och tekniskt utmanande papillära muskelremsor (t.ex. kaniner)18. Denna artikel beskrev en human in vitro-modell för att utvärdera effekterna av hjärtelektrofysiologiska medicintekniska signaler på kontraktilitet. Detta verktyg skulle kunna minska beroendet av djurstudier och vara användbart för in vitro-utvärdering av kontraktila egenskaper hos hjärtelektrofysiologiska enheter.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes delvis av ett möte till forskningsdeltagandeprogrammet vid Center for Devices and Radiological Health som administreras av Oak Ridge Institute for Science and Education genom ett interagenturavtal mellan US Department of Energy och US Food and Drug Administration. Författarna tackar Richard Gray, Trent Robertson och Anna Avila för deras förslag och tekniska hjälp. Studien finansierades genom US Food and Drug Administration, Office of Science and Engineering Laboratories.
0.1% Gelatin | STEMCELL Technologies | 7903 | Pre-plating Culture Substrate |
48-well Plate | MatTek | P48G-1.5-6-F | Hydrogel Substrate hiPSC-CM Culture, Glass |
6-well Plate | Thermofisher | 140675 | hiPSC-CM Culture, Plastic |
B-27 Supplement, with insulin | Invitrogen | 17504-044 | Cardiomyocyte Media |
Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) | Fisher Scientific | c70-500 | Tyrode’s solution |
CellOPTIQ Platform and Software | Clyde Biosciences | Contraction Recording and Analysis | |
Conical tube 15 mL | Corning | 352099 | hiPSC-CM Dissociation |
Digital CMOS Camera | Hamamatsu | C11440-42U30 | Contraction Video Recording |
D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | Cell Wash |
Environmental Control Chamber | OKOLAB INC | H201-K-FRAME | Environmental Regulation |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1kg | Tyrode’s solution |
Hemocytometer | Fisher Scientific | 22-600-107 | hiPSC-CM Counting |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s solution |
iCell Cardiomyocytes Plating Medium | Fujifilm Cellular Dynamic, Inc. | M1001 | hiPSC-CM Plating Media |
iCell Cardiomyocytes2, 01434 | Fujifilm Cellular Dynamic, Inc. | R1017 | hiPSC-CMs |
Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermofisher | 50116047 | Maintain hiPSC-CMs |
Inverted Microscope | Olympus | IX73 | Imaging hiPSC-CMs |
Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2) | Fisher Scientific | m33-500 | Tyrode’s solution |
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356230 | Flexible Hydrogel Substrate |
Microcentrifuge tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | Hydrogel Substrate Aliquot |
Model 4100 Isolated High Power Stimulator | AM-Systems | Model 4100 | Pulse Generator |
MyCell Cardiomyocytes DCM LMNA L35P, 01016 | Fujifilm Cellular Dynamic, Inc. | R1153 | DCM hiPSC-CMs |
Pen-Strep | Invitrogen | 15140-122 | Cardiomyocyte Media |
Pipette L-20 | Rainin | 17014392 | Plating Hydrogel Substrate |
Pipette P1000 | Fisher Scientific | F123602G | |
Pipette tips, 1000 ul | Fisher Scientific | 02-707-509 | |
Pipette tips, 20 ul | Rainin | GPS-L10S | Making Hydrogel Substrate |
Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P330-500 | Tyrode’s solution |
RPMI 1640, with glucose | Invitrogen | 11875 | Cardiomyocyte Media |
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | s641-212 | Tyrode’s solution |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465 | Tyrode’s solution |
Stimulation Electrodes | Pacing and CCM Stimulation | ||
Stopwatch/Timer | Fisher Scientific | 02-261-840 | Plating Hydrogel Substrate |
Trypan Blue Stain | Life Technologies | T10282 | hiPSC-CM Counting |
TrypLE Express | Life Technologies | 12605-010 | hiPSC-CM Dissociation |