מודל עכבר סיליקוזיס שנקבע על ידי שאיפה חוזרת ונשנית של אבק סיליקה גבישי
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לביסוס מודל עכברי של סיליקוזיס באמצעות חשיפה חוזרת ונשנית לתרחיפים של סיליקה באמצעות טפטוף אף. מודל זה יכול לחקות ביעילות, בנוחות ובגמישות את התהליך הפתולוגי של סיליקוזיס אנושי עם חזרתיות וחיסכון גבוהים.
Abstract
סיליקוזיס יכול להיגרם על ידי חשיפה לאבק סיליקה גבישי נשימתי (CSD) בסביבה תעשייתית. הפתופיזיולוגיה, הסינון והטיפול בסיליקוזיס בבני אדם נחקרו כולם בהרחבה באמצעות מודל הסיליקוזיס של העכבר. על-ידי גרימת עכברים לשאוף CSD שוב ושוב לריאותיהם, העכברים יכולים לחקות את הסימפטומים הקליניים של סיליקוזיס אנושי. מתודולוגיה זו מעשית ויעילה מבחינת זמן ותפוקה, ואינה גורמת לפגיעה מכנית בדרכי הנשימה העליונות עקב ניתוח. יתר על כן, מודל זה יכול לחקות בהצלחה תהליך טרנספורמציה חריפה/כרונית של סיליקוזיס. הנהלים העיקריים היו כדלקמן. אבקת CSD מעוקרת של 1-5 מיקרומטר נטחנה במלואה, מרחפת במי מלח ופוזרה באמבט מים על-קולי למשך 30 דקות. עכברים תחת הרדמה הנגרמת על ידי איזופלורן עברו מנשימה רדודה ומהירה לשאיפה עמוקה ואיטית במשך כ -2 שניות. העכבר הונח בכף יד, וקצה האגודל נגע בעדינות בקצה השפה של לסת העכבר כדי ליישר את נתיב האוויר. לאחר כל נשיפה, העכברים נשמו את תרחיף הסיליקה טיפה אחר טיפה דרך נחיר אחד, והשלימו את התהליך תוך 4-8 שניות. לאחר שנשימתם של העכברים התייצבה, ליטפו וליטפו את החזה שלהם כדי למנוע את שיעול ה-CSD בשאיפה. לאחר מכן הוחזרו העכברים לכלוב. לסיכום, מודל זה יכול לכמת CSD לאורך המעבר הפיזיולוגי הטיפוסי של חלקיקים זעירים לתוך הריאה, מדרכי הנשימה העליונות אל הסימפונות הסופניים ונאדיות. זה יכול גם לשכפל את החשיפה החוזרת ונשנית של עובדים עקב עבודה. המודל יכול להתבצע על ידי אדם אחד ואינו זקוק לציוד יקר. זה בנוחות וביעילות מדמה את תכונות המחלה של סיליקוזיס אנושי עם חזרתיות גבוהה.
Introduction
עובדים נחשפים באופן בלתי נמנע לאבק סיליקה גבישי לא סדיר (CSD), שניתן לשאוף והוא רעיל יותר בהקשרים תעסוקתיים רבים, כולל כרייה, כלי חרס, זכוכית, עיבוד קוורץ ובטון 1,2. מצב שאיפת אבק כרוני המכונה סיליקוזיס גורם לפיברוזיס ריאתי מתקדם3. על פי נתונים אפידמיולוגיים, שכיחות הסיליקוזיס נמצאת בירידה עולמית בעשורים האחרונים, אך בשנים האחרונות היא עולה ומשפיעה על צעירים 4,5,6. המנגנון הבסיסי של סיליקוזיס מהווה אתגר משמעותי למחקר המדעי בשל תחילתו החתרנית ותקופת הדגירה הממושכת. עדיין לא ידוע כיצד מתפתחת סיליקוזיס. יתר על כן, אין תרופות הנוכחיות יכול לעצור את התקדמות סיליקוזיס ופיברוזיס ריאתי הפוך.
המודלים הנוכחיים של עכבר עבור סיליקוזיס כוללים בליעה קנה הנשימה של השעיה מעורבת של CSD. לדוגמה, מתן CSD לריאות על ידי אימוץ טראומת קנה הנשימה הצווארית לאחר הרדמה אינו תואם חשיפה אנושית חוזרת ונשנית לאבק צבע7. ההשפעה של חשיפה לאבק סביבתי על אנשים ניתן ללמוד על ידי חשיפתם CSD בצורה של אירוסולים, אשר משקף בצורה מדויקת יותר את הריכוזים הסביבתיים של חומר רעיל זה8. עם זאת, CSD סביבתי לא יכול פשוט להיות שואף ישירות לתוך הריאות בשל המבנה הפיזיולוגי הייחודי של אף העכבר9. יתר על כן, הציוד הקשור לטכנולוגיה זו הוא יקר, מה שגרם לחוקרים להעריך מחדש את מודל סיליקוזיסעכבר 10. על ידי שאיפת תרחיף CSD דרך טפטוף אף חמש פעמים בתוך שבועיים, ניתן היה לבנות מודל דינמי של סיליקוזיס. דגם זה עקבי ובטוח ובו בזמן קל לשימוש. חשוב לציין כי מחקר זה מאפשר שאיפה חוזרת ונשנית של CSD בעכברים. מודל הסיליקוזיס של העכבר שנוצר באמצעות הליך זה צפוי להיות מועיל יותר לדרישות המחקר.
Protocol
Representative Results
Discussion
מודלים של עכברי סיליקוזיס חיוניים לחקר הפתוגנזה והטיפול בסיליקוזיס. פרוטוקול זה מתאר שיטה להכנת מודל של סיליקוזיס בעכברים באמצעות חשיפה חוזרת לאף. שיטה זו מאפשרת לחקור את המאפיינים הפתולוגיים של סיליקוזיס המושרה על ידי זמני חשיפה שונים. עכברים הורדמו והונשמו וקצב נשימתם נוטר. קצב הנשימה…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי תוכנית החדשנות הסינרגית האוניברסיטאית של מחוז אנחווי (GXXT-2021-077) וקרן החדשנות לבוגרי אוניברסיטת אנחווי למדע וטכנולוגיה (2021CX2120).
Materials
| 0.5 mL tube | Biosharp | BS-05-M | |
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | NA | |
| Adobe Illustrator | Adobe | NA | |
| Alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | NA | |
| CD68 | Abcam | ab125212 | |
| Citrate antigen retrieval solution | biosharp life science | BL619A | |
| DAB chromogenic kit | NJJCBio | W026-1-1 | |
| Dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | NA | |
| Enhanced BCA protein assay kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | Sa00001-2 | |
| Iceacetic acid | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | NA | |
| ImageJ | NIH | NA | |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | |
| Masson's Trichrome stain kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | NA | |
| Microtubes | Millipore | AXYMCT150CS | |
| NF-κB p65 | Cell Signaling Technology | 8242S | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | NA | |
| Paraffin embedding machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | NA | |
| Phosphate buffer (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | NA | |
| Pipettes | Eppendorf | NA | |
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| Prism7.0 | GraphPad | Version 7.0 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA lysis buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | NA | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxid | Sigma | #BCBV6865 | |
| Sirius red staining | Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd. | 181012 | |
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips (0.1–10 µL) | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips (100–1000 µL) | KIRGEN | KG1313 | |
| Universal Pipette Tips (1–200 µL) | KIRGEN | KG1212 | |
| Vortex mixer | VWR | NA | |
| ZEISS GeminiSEM 500 | Zeiss Germany | SEM 500 | |
| β-actin | Bioss | bs-0061R |
References
- Olsson, A., Kromhout, H. Occupational cancer burden: the contribution of exposure to process-generated substances at the workplace. Molecular Oncology. 15 (3), 753-763 (2021).
- The Lancet Respiratory. The world is failing on silicosis. The Lancet. Respiratory Medicine. 7 (4), 283 (2019).
- Weissman, D. N. Progressive massive fibrosis: An overview of the recent literature. Pharmacology & Therapeutics. 240, 108232 (2022).
- Lancet, C. C., Yu, I. T., Chen, W. Silicosis. Lancet. 379 (9830), 2008-2018 (2012).
- Mazurek, J. M., Wood, J., Blackley, D. J., Weissman, D. N. Coal workers’ pneumoconiosis-attributable years of potential life lost to life expectancy and potential life lost before age 65 years – United States, 1999-2016. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (30), 819-824 (2018).
- Voelker, R. Black Lung resurgence raises new challenges for coal country physicians. JAMA. 321 (1), 17-19 (2019).
- Nakashima, K., et al. Regulatory role of heme oxygenase-1 in silica-induced lung injury. Respiratory Research. 19 (1), 144 (2018).
- Li, Y., et al. Minute cellular nodules as early lesions in rats with silica exposure via inhalation. Veterinary Sciences. 9 (6), 251 (2022).
- Salehi, F., et al. Immunological responses in C3H/HeJ mice following nose-only inhalation exposure to different sizes of beryllium metal particles. Journal of Applied Toxicology. 29 (1), 61-68 (2009).
- Yang, T., et al. Emodin suppresses silica-induced lung fibrosis by promoting Sirt1 signaling via direct contact. Molecular Medicine Reports. 14 (5), 4643-4649 (2016).
- Cornell, W. C., et al. Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Mu, M., et al. Coal dust exposure triggers heterogeneity of transcriptional profiles in mouse pneumoconiosis and Vitamin D remedies. Particle and Fibre Toxicology. 19 (1), 7 (2022).
- Kato, K., et al. Muc1 deficiency exacerbates pulmonary fibrosis in a mouse model of silicosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 493 (3), 1230-1235 (2017).
- Liu, F., et al. CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells depletion may attenuate the development of silica-induced lung fibrosis in mice. PLoS One. 5 (11), 15404 (2010).
- Mansouri, N., et al. Mesenchymal stromal cell exosomes prevent and revert experimental pulmonary fibrosis through modulation of monocyte phenotypes. JCI Insight. 4 (21), 128060 (2019).
- Ohtsuka, Y., Wang, X. T., Saito, J., Ishida, T., Munakata, M. Genetic linkage analysis of pulmonary fibrotic response to silica in mice. The European Respiratory Journal. 28 (5), 1013-1019 (2006).
