मानव कोरोनावायरस-होस्ट इंटरैक्शन को चिह्नित करने के लिए एक वायु-तरल इंटरफ़ेस पर विकसित प्राथमिक नाक उपकला कोशिकाओं का संक्रमण
Summary
नाक उपकला सभी श्वसन रोगजनकों द्वारा सामना की जाने वाली प्राथमिक बाधा साइट है। यहां, हम शारीरिक रूप से प्रासंगिक प्रणाली में मानव कोरोनावायरस-होस्ट इंटरैक्शन को चिह्नित करने के लिए वायु-तरल इंटरफ़ेस (एएलआई) संस्कृतियों के रूप में विकसित प्राथमिक नाक उपकला कोशिकाओं का उपयोग करने के तरीकों की रूपरेखा तैयार करते हैं।
Abstract
तीन अत्यधिक रोगजनक मानव कोरोनावायरस (एचसीओवी) – सार्स-सीओवी (2002), एमईआरएस-सीओवी (2012), और सार्स-सीओवी-2 (2019) – उभरे हैं और पिछले 20 वर्षों में महत्वपूर्ण सार्वजनिक स्वास्थ्य संकट पैदा किए हैं। चार अतिरिक्त एचसीओवी हर साल सामान्य सर्दी के मामलों (एचसीओवी-एनएल 63, -229 ई, -ओसी 43, और -एचकेयू 1) के एक महत्वपूर्ण हिस्से का कारण बनते हैं, जो शारीरिक रूप से प्रासंगिक प्रणालियों में इन वायरस का अध्ययन करने के महत्व पर प्रकाश डालते हैं। एचसीओवी श्वसन पथ में प्रवेश करते हैं और नाक उपकला में संक्रमण स्थापित करते हैं, जो सभी श्वसन रोगजनकों द्वारा सामना की जाने वाली प्राथमिक साइट है। हम एक प्राथमिक नाक उपकला संस्कृति प्रणाली का उपयोग करते हैं जिसमें इस महत्वपूर्ण प्रहरी स्थल पर मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए रोगी-व्युत्पन्न नाक के नमूने एक वायु-तरल इंटरफ़ेस (एएलआई) पर उगाए जाते हैं। ये संस्कृतियां विवो वायुमार्ग की कई विशेषताओं को पुन: प्रस्तुत करती हैं, जिसमें सेल प्रकार मौजूद हैं, सिलिअरी फ़ंक्शन और बलगम उत्पादन। हम एचसीओवी संक्रमण के बाद नाक एएलआई संस्कृतियों में वायरल प्रतिकृति, मेजबान सेल ट्रोपिज्म, वायरस-प्रेरित साइटोटॉक्सिसिटी और जन्मजात प्रतिरक्षा प्रेरण को चिह्नित करने के तरीकों का वर्णन करते हैं, उदाहरण1 के रूप में घातक और मौसमी एचसीओवी की तुलना करने वाले हालिया काम का उपयोग करते हैं। नाक में मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन की बढ़ती समझ में एचसीओवी और अन्य श्वसन वायरस के खिलाफ एंटीवायरल चिकित्सीय के लिए नए लक्ष्य प्रदान करने की क्षमता है जो भविष्य में उभरने की संभावना है।
Introduction
अब तक सात मानव कोरोनावायरस (एचसीओवी) की पहचान की गई है और यहश्वसन रोगों की एक श्रृंखला का कारण बनता है। सामान्य या मौसमी एचसीओवी (एचसीओवी-एनएल 63, -229 ई, -ओसी 43, और -एचकेयू 1) आमतौर पर ऊपरी श्वसन पथ विकृति से जुड़े होते हैं और सालाना अनुमानित 10% -30% सामान्य सर्दी के मामलों का कारण बनते हैं। हालांकि यह सामान्य एचसीओवी से जुड़ा विशिष्ट नैदानिक फेनोटाइप है, ये वायरस बच्चों, बड़े वयस्कों और इम्युनोकॉम्प्रोमाइज्डव्यक्तियों सहित जोखिम वाली आबादी में अधिक महत्वपूर्ण निचले श्वसन पथ की बीमारी का कारण बन सकते हैं। पिछले 20 वर्षों में तीन रोगजनक एचसीओवी उभरे हैं और महत्वपूर्ण सार्वजनिक स्वास्थ्य आपात स्थिति पैदा की हैं, जिनमें गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम (सार्स)-सीओवी, मध्य पूर्व श्वसन सिंड्रोम (एमईआरएस)-सीओवी और सार्स-सीओवी-2 शामिल हैं। घातक एचसीओवी अधिक गंभीर श्वसन पथ विकृति से जुड़े होते हैं, जो स्पष्ट रूप से एमईआरएस-सीओवी मामलों से जुड़े >34% मामले-मृत्यु दर (2012 में इसके उद्भव के बाद से 2,500 से अधिक मामलों से 894 मौतें) 5,6 द्वारा चित्रित किया गया है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि घातक एचसीओवी श्वसन पथ के रोगों की एक श्रृंखला का कारण बनते हैं, जिसमें स्पर्शोन्मुख संक्रमण से लेकर घातक निमोनिया तक शामिल हैं, जैसा कि चल रहे सीओवीआईडी -19 महामारी7 के साथ देखा गया है।
एचसीओवी, अन्य श्वसन रोगजनकों की तरह, श्वसन पथ में प्रवेश करते हैं और नाक उपकला8 में एक उत्पादक संक्रमण स्थापित करते हैं। निचले वायुमार्ग में फैलने को मौखिक / नाक गुहा से फेफड़ों तक आकांक्षा से जुड़ा हुआ माना जाता है, जहां एचसीओवी अधिक महत्वपूर्ण निचले श्वसन पथ विकृति 9,10,11 का कारण बनता है। इस प्रकार, नाक वायरल प्रवेश के लिए प्रारंभिक पोर्टल के रूप में कार्य करता है और इसकी मजबूत म्यूकोसिलरी क्लीयरेंस मशीनरी और अद्वितीय जन्मजात प्रतिरक्षा तंत्र के साथ संक्रमण के लिए प्राथमिक बाधा है जिसका उद्देश्य निचले वायुमार्ग12,13 में आगे वायरल प्रसार को रोकना है। उदाहरण के लिए, नाक उपकला कोशिकाओं को एंटीवायरल इंटरफेरॉन और इंटरफेरॉन-उत्तेजित जीन के औसत बेसल स्तर से अधिक व्यक्त करने की सूचना दी गई है, यह दर्शाता है कि श्वसन वायरस14,15,16 के लिए प्रारंभिक प्रतिक्रियाओं के लिए नाक की कोशिकाएं प्रमुख हो सकती हैं।
हमने पहले नाक में एचसीओवी-होस्ट इंटरैक्शन को मॉडल करने के लिए वायु-तरल इंटरफ़ेस (एएलआई) में विकसित रोगी-व्युत्पन्न प्राथमिक नाक उपकला कोशिकाओं का उपयोग किया है, जहां एचसीओवी संक्रमण शुरू होता है। नाक की एएलआई संस्कृतियां रोगजनक (सार्स-सीओवी-2 और एमईआरएस-सीओवी) और सामान्य एचसीओवी (एचसीओवी-एनएल63 और एचसीओवी-229ई) दोनों के लिए अनुमेय हैं और पारंपरिक वायुमार्ग उपकला कोशिका लाइनों जैसे ए 549 (एक फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा सेल लाइन) 16,17 पर विभिन्न लाभ प्रदान करती हैं। भेदभाव के बाद, नाक एएलआई संस्कृतियों में एक विषम सेलुलर आबादी होती है और विवो नाक उपकला में अपेक्षित कई कार्यों का प्रदर्शन करती है, जैसे कि म्यूकोसिलरी क्लीयरेंस मशीनरी18। नाक कोशिकाएं निचले वायुमार्ग संस्कृति प्रणालियों (जैसे मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं, एचबीईसी) पर भी लाभ प्रदान करती हैं, क्योंकि साइटोलॉजिकल ब्रशिंग के माध्यम से नाक उपकला कोशिकाओं का अधिग्रहण एचबीईसी 19,20,21 प्राप्त करने के लिए ब्रोंकोस्कोपी जैसी तकनीकों का उपयोग करने की तुलना में काफी कम आक्रामक है।
यह पेपर नाक उपकला में एचसीओवी-होस्ट इंटरैक्शन को चिह्नित करने के लिए इस नाक एएलआई संस्कृति प्रणाली का उपयोग करने के तरीकों का वर्णन करता है। हमने सार्स-सीओवी-2, एमईआरएस-सीओवी, एचसीओवी-एनएल63 और एचसीओवी-229ई 1,16,17 की तुलना करने के लिए हाल ही में प्रकाशित कार्यों में इन तरीकों को लागू किया है। हालांकि ये विधियां और प्रतिनिधि परिणाम इस नाक सेल मॉडल में एचसीओवी के अध्ययन पर जोर देते हैं, सिस्टम अन्य एचसीओवी, साथ ही अन्य श्वसन रोगजनकों के लिए अत्यधिक अनुकूलनीय है। इसके अलावा, इन विधियों को वायरल प्रतिकृति और सेलुलर ट्रोपिज्म, साथ ही संक्रमण के बाद साइटोटॉक्सिसिटी और जन्मजात प्रतिरक्षा प्रेरण की जांच करने के लिए अन्य एएलआई संस्कृति प्रणालियों पर अधिक व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां विस्तृत तरीके एक प्राथमिक उपकला संस्कृति प्रणाली का वर्णन करते हैं जिसमें रोगी-व्युत्पन्न नाक उपकला कोशिकाओं को एक वायु-तरल इंटरफ़ेस पर उगाया जाता है और एचसीओवी-होस्ट इंटरैक्शन के अध्ययन के लिए…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन में निम्नलिखित वित्त पोषण स्रोत हैं: राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) आर01एआई 169537 (एसआरडब्ल्यू और एनएसी), एनआईएच आर01एआई 140442 (एसआरडब्ल्यू), वीए मेरिट रिव्यू CX001717 (एनएसी), वीए मेरिट रिव्यू BX005432 (एसआरडब्ल्यू और एनएसी), पेन सेंटर फॉर रिसर्च ऑन कोरोनावायरस और अन्य उभरते रोगजनकों (एसआरडब्ल्यू), लाफी-मैकहग फाउंडेशन (एसआरडब्ल्यू) टी 32 AI055400 (सीजेओ), टी 32 AI007324 (एएफ)।
Materials
| Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647) | Invitrogen | Various | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Cytotoxicity detection kit | Roche | 11644793001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | Gibco | 11965-084 | |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco | 14190136 | |
| DPBS + calcium + magnesium | Gibco | 14040-117 | |
| Endohm-6G measurement chamber | World Precision Instruments | ENDOHM-6G | |
| Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326) | eBiosciences | 14-9326-82 | |
| Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM) | World Precision Instruments | 300523 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | HyClone | SH30071.03 | |
| FV10-ASW software for imaging | Olympus | Version 4.02 | |
| HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63) | BEI Resources | NR-470 | |
| HCoV-NL63 nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40641-V07E | |
| Hoescht stain | Thermo Fisher | H3570 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BIO-RAD | 1610747 | |
| LLC-MK2 cells | ATCC | CCL-7 | To titrate HCoV-NL63 |
| MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012) | BEI Resources | NR-44260 | |
| MERS-CoV nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40068-MM10 | |
| MUC5AC antibody | Sigma-Aldrich | AMAB91539 | |
| Olympus Fluoview confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Phalloidin-iFluor 647 stain | Abcam | ab176759 | |
| PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors) | Roche | PHOSS-RO | |
| Plate reader | Perkin Elmer | HH34000000 | Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm |
| RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40) | Thermo Fisher | 89990 | Can prep in-house or purchase |
| RNeasy Plus Kit | Qiagen | 74134 | |
| SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020) | BEI Resources | NR-52281 | |
| SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody | Genetex | GTX135357 | |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151100 | |
| Type IV β- tubulin antibody | Abcam | ab11315 | |
| VeroCCL81 cells | ATCC | CCL-81 | To titrate MERS-CoV |
| VeroE6 cells | ATCC | CRL-1586 | To titrate SARS-CoV-2 |
References
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