Dissection de tissu pancréatique pour isoler des cellules uniques viables

Résumé

Les cellules métaplasiques pancréatiques sont des précurseurs de cellules malignes à l’origine des tumeurs pancréatiques. Cependant, il est difficile d’isoler des cellules pancréatiques viables intactes. Nous présentons ici une méthode efficace de dissociation du tissu pancréatique. Les cellules peuvent ensuite être utilisées pour le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) ou pour la co-culture bidimensionnelle ou tridimensionnelle.

Résumé

Le pancréas comprend deux systèmes principaux : le système endocrinien, qui produit et sécrète des hormones, et le système exocrinien, qui représente environ 90 % du pancréas et comprend des cellules qui produisent et sécrètent des enzymes digestives. Les enzymes digestives sont produites dans les cellules acineuses pancréatiques, stockées dans des vésicules appelées zymogènes, et sont ensuite libérées dans le duodénum via le canal pancréatique pour initier des processus métaboliques. Les enzymes produites par les cellules acineuses peuvent tuer les cellules ou dégrader l’ARN acellulaire. De plus, les cellules acineuses sont fragiles et les protocoles de dissociation courants entraînent un grand nombre de cellules mortes et de protéases et de RNases acellulaires. Par conséquent, l’un des plus grands défis de la digestion des tissus pancréatiques est de récupérer des cellules intactes et viables, en particulier les cellules acineuses. Le protocole présenté dans cet article montre une méthode en deux étapes que nous avons développée pour répondre à ce besoin. Le protocole peut être utilisé pour digérer un pancréas normal, un pancréas qui comprend des lésions précancéreuses ou des tumeurs pancréatiques qui comprennent un grand nombre de cellules stromales et immunitaires.

Introduction

L’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est l’un des types de cancer les plus agressifs¹. Les preuves cliniques soutiennent l’idée que la PDAC se développe à partir de cellules du système exocrinien, y compris les cellules acineuses, sur de nombreuses années, sous l’effet de mutations dans le proto-oncogène² KRAS.

Les tumeurs pancréatiques comprennent de nombreux types de cellules différentes, et il a été démontré que les cellules malignes ne représentent que 20 à 50 % de la masse tumorale³. Différents types de cellules interagissent avec les cellules épithéliale....

Protocole

Le comité mixte d’éthique (Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux) de l’Université hébraïque (Jérusalem, Israël) et du Centre médical Hadassah (Jérusalem, Israël) a approuvé le protocole d’étude pour le bien-être animal (MD-18-15417-5 « Dynamique tissulaire dans le cancer du pancréas chez la souris »), et le protocole présenté ici était conforme à toutes les règles éthiques pertinentes pour l’expérimentation et la recherche sur les animaux. L’Université hébraïque est un institut accrédité par l’Association pour l’évaluation et l’accréditation des soins aux animaux de laboratoire à l’échelle internationale.

NOTE : L....

Résultats

Dans un travail récemment publié⁵, nous avons appliqué le protocole décrit ci-dessus pour explorer les premières étapes du développement de la PDAC à l’aide d’un modèle murin. La souris a été génétiquement modifiée pour inclure les cassettes Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato⁷, qui permettent l’expression de KRAS constitutivement actif dans les cellules acineuses après injection de tamoxifène.

Ap.......

Discussion

Dans cet article, nous vous présentons un protocole de dissociation du tissu pancréatique. Le protocole est simple, facile à utiliser et fournit un outil pour isoler des cellules uniques viables du tissu pancréatique à différents stades du processus de malignité, y compris les tumeurs solides. Dans des études antérieures, différents types de collagénases ont été utilisés pour digérer le pancréas ^8,9. L’utilisation d’une collagénase très puissante, telle que la co.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactif ou Ressource
70 µ ; maille en nylon m  ;	Corning	cat##431751
BSA	Sigma Aldrich	cat# A7906
Collagenase P	Roche	cat# 11213857001
Critical Commercial Assay
DAPI	Sigma Aldrich	cat#MBD0015
Dnase I	Roche	cat# 10104159001
Modèles expérimentaux : Organismes/ Souches
Sérum fœtal bovin Sud-américain	ThermoFisher	Cat#10270106
Hanks' Balanced Salt Solution	Biological industries	cat#02-018-1A  ;
KRASLSL-G12D souris	Jackson Laboratory	JAX008179
MACS kit d’élimination des cellules mortes	Milteny Biotec	cat#130-090-101
PBS	Biological industries	cat#02-023-1A  ;
Ptf1a-CreER mice	Jackson Laboratory	JAX019378
Ptf1a-CreER ; Rosa26LSL-tdTomato mice	Jackson Laboratory	JAX007908
Trypsine C-EDTA 0.05	%Industries biologiques	cat# 03-053-1A
Trypsine inhibiteur	Roche	cat#T6522