بروتوكول بسيط لرسم خرائط سمات بنية نظام جذر النبات
Summary
نحن نستخدم أدوات معملية بسيطة لفحص بنية نظام الجذر (RSA) ل Arabidopsis و Medicago. تزرع النباتات في الماء فوق شبكة وتنتشر باستخدام فرشاة فنية للكشف عن RSA. يتم التقاط الصور باستخدام المسح الضوئي أو كاميرا عالية الدقة ، ثم يتم تحليلها باستخدام ImageJ لتعيين السمات.
Abstract
تعد المعرفة الشاملة بتطوير بنية نظام جذر النبات (RSA) أمرا بالغ الأهمية لتحسين كفاءة استخدام المغذيات وزيادة تحمل أصناف المحاصيل للتحديات البيئية. يتم تقديم بروتوكول تجريبي لإعداد نظام الزراعة المائية ، ونمو النباتات ، وانتشار RSA ، والتصوير. استخدم النهج نظاما مائيا قائما على صندوق أرجواني يحتوي على شبكة من مادة البولي بروبيلين مدعومة بأسافين من البولي كربونات. يتم توضيح الإعدادات التجريبية من خلال تقييم RSA للنباتات تحت إمدادات المغذيات المختلفة (الفوسفات [Pi]). تم إنشاء النظام لفحص RSA من Arabidopsis ، لكنه قابل للتكيف بسهولة لدراسة النباتات الأخرى مثل Medicago sativa (البرسيم). تستخدم نباتات Arabidopsis thaliana (Col-0) في هذا التحقيق كمثال لفهم نبات RSA. يتم تعقيم البذور السطحية عن طريق معالجة الإيثانول والتبييض التجاري المخفف ، ويتم الاحتفاظ بها عند 4 درجات مئوية للتقسيم الطبقي. تنبت البذور وتزرع على وسط سائل نصف MS على شبكة من مادة البولي بروبيلين مدعومة بأسافين من البولي كربونات. تزرع النباتات في ظل ظروف النمو القياسية لعدد الأيام المطلوبة ، ويتم انتقاؤها برفق من الشبكة ، وتغمرها في ألواح أجار تحتوي على الماء. ينتشر كل نظام جذر للنباتات برفق على الصفيحة المملوءة بالماء بمساعدة فرشاة فنية مستديرة. يتم تصوير لوحات بتري هذه أو مسحها ضوئيا بدقة عالية لتوثيق سمات RSA. يتم قياس سمات الجذر ، مثل الجذر الأساسي والجذور الجانبية ومنطقة التفرع ، باستخدام برنامج ImageJ المتاح مجانا. توفر هذه الدراسة تقنيات لقياس خصائص جذور النبات في البيئات البيئية الخاضعة للرقابة. نناقش كيفية (1) زراعة النباتات ، وجمع عينات الجذر ونشرها ، (2) الحصول على صور لعينات RSA المنتشرة ، (3) التقاط الصور ، و (4) استخدام برنامج تحليل الصور لتحديد سمات الجذر. ميزة الطريقة الحالية هي القياس متعدد الاستخدامات والسهل والفعال لسمات RSA.
Introduction
تعد بنية نظام الجذر (RSA) ، الموجودة تحت الأرض ، عضوا حيويا لنمو النبات وإنتاجيته1،2،3. بعد المرحلة الجنينية ، تخضع النباتات لأهم التغييرات المورفولوجية. تؤثر الطريقة التي تنمو بها الجذور في التربة بشكل كبير على نمو أجزاء النبات فوق سطح الأرض. نمو الجذر هو الخطوة الأولى في الإنبات. إنها سمة إعلامية لأنها تستجيب بشكل فريد للعناصر الغذائية المختلفة المتاحة1،2،3،4. يظهر RSA درجة عالية من اللدونة التنموية ، مما يعني أن البيئة تستخدم دائما لاتخاذ قرارات بشأن التطوير 2,5. وقد جعلت التغيرات في البيئة إنتاج المحاصيل أكثر صعوبة في السيناريو الحالي. على أساس مستمر ، يدمج RSA الإشارات البيئية في الخيارات التنموية5. نتيجة لذلك ، يعد الفهم الشامل للمبادئ الكامنة وراء تطور الجذور أمرا ضروريا لتعلم كيفية استجابة النباتات للبيئات المتغيرة 2,5.
يستشعر RSA تركيزات المغذيات المختلفة ويجعل التغيرات الظاهرية4،6،7،8،9،10،11،12. تشير الدراسات إلى أن مورفولوجيا الجذر / RSA شديدة اللدائن مقارنة بمورفولوجيا البراعم 1,3. يعد رسم خرائط سمات RSA فعالا للغاية في تسجيل تأثير تغيير بيئة التربة المحيطة1،11،12.
بشكل عام ، تم الإبلاغ عن تناقضات في تأثير نقص المغذيات المختلفة على النمط الظاهري للجذر في العديد من الدراسات السابقة3،11،13،14،15. على سبيل المثال ، هناك العديد من التقارير المتناقضة حول التغيرات الناجمة عن تجويع الفوسفات (Pi) في عدد وطول وكثافة الجذور الجانبية (LRs). تم الإبلاغ عن زيادة في كثافة LR في ظل حالة نقص Pi 6,8. في المقابل ، تم الإبلاغ أيضا عن انخفاض في كثافة LR في ظل ظروف نقص Pi من قبل مؤلفين آخرين3،13،16. أحد الأسباب البارزة لهذه التناقضات هو استخدام وسط التبلور المعرض للتلوث الأولي ، والذي يحتوي الآجار غالبا على10. عادة ما يزرع الباحثون نباتاتهم التجريبية على نظام صفيحة قائم على أجار ويسجلون سمات الجذر. غالبا ما يتم إخفاء العديد من سمات RSA أو ترسيخها داخل مادة الآجار ولا يمكن توثيقها. لا يمكن إجراء التجارب المرتبطة بإحداث نقص المغذيات ، والتي غالبا ما يستبعد فيها المستخدمون مكونا واحدا تماما من الوسط ، في وسط التبلور المعرض للتلوث الأولي11،14،15. توجد العديد من العناصر الغذائية بشكل متكرر بكميات كبيرة في وسائط الآجار ، بما في ذلك P و Zn و Fe وغيرها الكثير11،14،15. علاوة على ذلك ، يكون نمو RSA أبطأ في الوسائط القائمة على الأجار منه في الوسط السائل غير القائم على أجار. ونتيجة لذلك، هناك حاجة إلى وضع نهج بديل غير قائم على الآجار لتحديد النمط الظاهري ل RSA وتسجيله نوعيا. وبالتالي ، تم تطوير الطريقة الحالية ، حيث يتم تربية النباتات في نظام مائي قائم على صندوق أرجواني فوق شبكة من مادة البولي بروبيلين مدعومة بأسافين من البولي كربونات1،10،11.
تقدم هذه الدراسة نسخة مرتجلة مفصلة من الطريقة السابقة التي وصفها Jain et al.10. تم ضبط هذه الاستراتيجية للمتطلبات الحالية في بيولوجيا جذور النبات ويمكن استخدامها أيضا لنباتات مثل البرسيم ، بخلاف النباتات النموذجية. البروتوكول هو الطريقة الأساسية لقياس التغييرات في RSA ، ولا يتطلب سوى معدات بسيطة. يوضح هذا البروتوكول كيفية التنميط الظاهري للعديد من السمات الجذرية ، مثل الجذور الأولية والجانبية في الوسط العادي والمعدل (Pi ناقص). يتم توفير توجيهات خطوة بخطوة وتلميحات مفيدة أخرى مستقاة من تجارب المؤلف لمساعدة الباحثين على متابعة المنهجيات المقدمة في هذه الطريقة. تهدف الدراسة الحالية إلى توفير طريقة بسيطة وفعالة للكشف عن نظام الجذر الكامل للنباتات ، بما في ذلك LRs ذات الترتيب الأعلى. تتضمن هذه الطريقة نشر نظام الجذر يدويا باستخدام فرشاة فنية مستديرة بالألوان المائية ، مما يسمح بالتحكم الدقيق في تعرض الجذور1،10،11،12. لا يتطلب معدات باهظة الثمن أو برامج معقدة. وقد حسنت هذه الطريقة امتصاص المغذيات ومعدل النمو. تحتوي النباتات على محلول غني بالمغذيات تمتصه جذورها بسهولة. الطريقة الحالية مناسبة للباحثين الذين يرغبون في رسم خريطة لسمات نظام جذر النبات بالتفصيل ، خاصة أثناء التطور المبكر (10-15 يوما بعد الإنبات). إنها مناسبة لأنظمة الجذور الصغيرة ، والنباتات النموذجية مثل Arabidopsis والتبغ ، والنباتات غير التقليدية مثل البرسيم حتى يتناسب نظام الجذر الخاص بها مع الصناديق الأرجواني.
تم توضيح خطوات تحليل النمط الظاهري لتطوير RSA في Arabidopsis في هذا البروتوكول على النحو التالي: (1) طريقة تعقيم سطح البذور للنباتات (Arabidopsis) ، (2) خطوات إعداد نظام الزراعة المائية ، متبوعا ببذر البذور على وسط ، (3) إجراء لإخراج البذور الكاملة ونشرها على صفيحة بتري لتحليل RSA ، (4) كيفية تسجيل الصور ل RSA ، و (5) حساب معلمات RSA المهمة باستخدام برنامج ImageJ.
Protocol
Representative Results
Discussion
أظهر هذا العمل رسم خرائط RSA باستخدام معدات معملية بسيطة. باستخدام هذه الطريقة ، يتم تسجيل التغيرات المظهرية على المستوى المكرر. تتمثل فائدة هذه الإستراتيجية في أن جزء الساق لا يتلامس أبدا مع الوسائط ، لذا فإن النمط الظاهري للنباتات أصلي. تتضمن هذه الطريقة إنشاء نظام مائي لزراعة النباتات ك?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نقدر وزارة الزراعة الأمريكية (المنحة 58-6406-1-017) لدعم هذا البحث. كما نعرب عن تقديرنا لمركز التكنولوجيا الحيوية WKU ، جامعة ويسترن كنتاكي ، بولينغ غرين ، كنتاكي ، الولايات المتحدة الأمريكية ، ومدير المعهد المركزي للنباتات الطبية والعطرية CSIR ، لكناو ، الهند ، لتوفير مرافق الأدوات والدعم (اتصال مخطوطة CSIR CIMAP رقم CIMAP / PUB / 2022/103). تقر SS بالدعم المالي من جامعة سانت جوزيف ، فيلادلفيا ، الولايات المتحدة الأمريكية.
Materials
| Arabidospsis thaliana (Col 0) | Lehle Seeds | WT-02 | Columbia (Col-0**, no markers)* |
| Art brushes | Amazon or any other vendor | Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm) | |
| Automated Microscope with digital camera | Leica Microsystems | LAS version 4.12.0, Leica Microsystems | |
| Imaging Software | ImageJ | ImageJ V 1.8.0 |
|
| Magenta box GA-7 | Fisher Scientific | 50-255-176 | |
| Medicago sativa | Johnny's Seeds | ||
| Petri-plate (150 mm x 15 mm) | USA Scientific | 8609-0215 | 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com) |
| Photo camera | Cannon or Nikon | Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode | |
| Plant-Agar | Sigma-Aldrich | A3301 | Agargel Suitable for plant tissue culture |
| Polycarbonate Sheets | Amazon | 1 mm thick | |
| Polypropylene Mesh | Amazon | Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm | |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi) |
References
- Shukla, D., Rinehart, C. A., Sahi, S. V. Comprehensive study of excess phosphate response reveals ethylene mediated signaling that negatively regulates plant growth and development. Scientific Reports. 7 (1), 3074 (2017).
- Rellán-Álvarez, R., Lobet, G., Dinneny, J. R. Environmental control of root system biology. Annual Review of Plant Biology. 67, 619-642 (2016).
- Gruber, B. D., Giehl, R. F. H., Friedel, S., von Wirén, N. Plasticity of the Arabidopsis root system under nutrient deficiencies. Plant Physiology. 163 (1), 161-179 (2013).
- Shukla, D., et al. Genome-wide expression analysis reveals contrasting regulation of phosphate starvation response (PSR) in root and shoot of Arabidopsis and its association with biotic stress. Environmental and Experimental Botany. , 188 (2021).
- Robbins 2nd, ., E, N., Dinneny, J. R. Growth is required for perception of water availability to pattern root branches in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), E822-E831 (2018).
- Linkohr, B. I., Williamson, L. C., Fitter, A. H., Leyser, H. M. O. Nitrate and phosphate availability and distribution have different effects on root system architecture of Arabidopsis. The Plant Journal. 29 (6), 751-760 (2002).
- Lynch, J. P., Brown, K. M. Topsoil foraging: an architectural adaptation of plants to low phosphorus availability. Plant and Soil. 237 (2), 225-237 (2001).
- López-Bucio, J., et al. Phosphate availability alters architecture and causes changes in hormone sensitivity in the Arabidopsis root system. Plant Physiology. 129 (1), 244-256 (2002).
- Jain, A., et al. Differential effects of sucrose and auxin on localized phosphate deficiency-induced modulation of different traits of root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 144 (1), 232-247 (2007).
- Jain, A., et al. Variations in the composition of gelling agents affect morphophysiological and molecular responses to deficiencies of phosphate and other nutrients. Plant Physiology. 150 (2), 1033-1049 (2009).
- Jain, A., Sinilal, B., Dhandapani, G., Meagher, R. B., Sahi, S. V. Effects of deficiency and excess of zinc on morphophysiological traits and spatiotemporal regulation of zinc-responsive genes reveal incidence of cross talk between micro- and macronutrients. Environmental Science and Technology. 47 (10), 5327-5335 (2013).
- Jain, A., et al. Role of Fe-responsive genes in bioreduction and transport of ionic gold to roots of Arabidopsis thaliana during synthesis of gold nanoparticles. Plant Physiology and Biochemistry. 84, 189-196 (2014).
- Williamson, L. C., Ribrioux, S. P., Fitter, A. H., Leyser, H. M. Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 126 (2), 875-882 (2001).
- Yang, T. J. W., Lin, W. D., Schmidt, W. Transcriptional profiling of the Arabidopsis iron deficiency response reveals conserved transition metal homeostasis networks. Plant Physiology. 152 (4), 2130 (2010).
- Kobae, Y., et al. Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis. Plant Cell and Physiology. 45 (12), (2004).
- Al-Ghazi, Y., et al. Temporal responses of Arabidopsis root architecture to phosphate starvation: evidence for the involvement of auxin signalling. Plant, Cell and Environment. 26 (7), 1053-1066 (2003).
- S, U. . National Institutes of Health. , 1997-2007 (1997).
- Dubrovsky, J. G., Forde, B. G. Quantitative analysis of lateral root development: pitfalls and how to avoid them. The Plant Cell. 24 (1), 4-14 (2012).
- Weeks, J. T., Ye, J., Rommens, C. M. Development of an in planta method for transformation of Alfalfa (Medicago sativa). Transgenic Research. 17 (4), 587-597 (2008).
- Shukla, D., Krishnamurthy, S., Sahi, S. V. Microarray analysis of Arabidopsis under gold exposure to identify putative genes involved in the synthesis of gold nanoparticles (AuNPs).Genomics Data. 3, 100-102 (2015).
