En simpel protokol til kortlægning af plantens rodsystemarkitekturegenskaber
Summary
Vi bruger enkle laboratorieværktøjer til at undersøge rodsystemarkitekturen (RSA) af Arabidopsis og Medicago. Planterne dyrkes hydroponisk over mesh og spredes ved hjælp af en kunstbørste for at afsløre RSA. Billeder tages ved hjælp af scanning eller et kamera med høj opløsning og analyseres derefter med ImageJ for at kortlægge træk.
Abstract
Omfattende viden om udvikling af planterodssystemarkitektur (RSA) er afgørende for at forbedre effektiviteten af næringsstofudnyttelsen og øge afgrødesortens tolerance over for miljømæssige udfordringer. En eksperimentel protokol præsenteres til opsætning af hydroponisk system, plantlet vækst, RSA spredning og billeddannelse. Fremgangsmåden anvendte et magenta boxbaseret hydroponisk system indeholdende polypropylennet understøttet af polycarbonatkiler. Eksperimentelle indstillinger eksemplificeres ved at vurdere planternes RSA under varierende næringsstofforsyning (fosfat [Pi]). Systemet blev etableret for at undersøge RSA af Arabidopsis, men det er let at tilpasse til at studere andre planter som Medicago sativa (lucerne). Arabidopsis thaliana (Col-0) plantlets anvendes i denne undersøgelse som et eksempel til at forstå planten RSA. Frøene overfladesteriliseres ved behandling af ethanol og fortyndet kommercielt blegemiddel og opbevares ved 4 °C til stratificering. Frøene spires og dyrkes på et flydende halv-MS-medium på et polypropylennet understøttet af polykarbonatkiler. Planterne dyrkes under standardvækstbetingelser i det ønskede antal dage, forsigtigt plukket ud af masken og nedsænket i vandholdige agarplader. Hvert rodsystem af planterne spredes forsigtigt på den vandfyldte plade ved hjælp af en rund kunstbørste. Disse petriplader fotograferes eller scannes i høj opløsning for at dokumentere RSA-egenskaberne. Rodegenskaberne, såsom primær rod, laterale rødder og forgreningszone, måles ved hjælp af den frit tilgængelige ImageJ-software. Denne undersøgelse giver teknikker til måling af planters rodegenskaber i kontrollerede miljøindstillinger. Vi diskuterer, hvordan man (1) dyrker planterne og indsamler og spreder rodprøver, (2) får billeder af spredte RSA-prøver, (3) fanger billederne og (4) bruger billedanalysesoftware til at kvantificere rodattributter. Fordelen ved den nuværende metode er den alsidige, nemme og effektive måling af RSA-egenskaberne.
Introduction
Rodsystemarkitekturen (RSA), som er under jorden, er et vigtigt organ for plantevækst og produktivitet 1,2,3. Efter fosterstadiet gennemgår planter deres mest betydningsfulde morfologiske ændringer. Den måde, hvorpå rødderne vokser i jorden, påvirker i høj grad væksten af plantedele over jorden. Rødvækst er det første skridt i spiring. Det er et informativt træk, da det unikt reagerer på forskellige tilgængelige næringsstoffer 1,2,3,4. RSA udviser en høj grad af udviklingsmæssig plasticitet, hvilket betyder, at miljøet altid bruges til at træffe beslutninger om udvikling 2,5. Ændringer i miljøet har vanskeliggjort afgrødeproduktionen i det nuværende scenario. RSA indarbejder løbende miljøsignaler i udviklingsvalg5. Som følge heraf er en grundig forståelse af principperne bag rodudvikling afgørende for at lære, hvordan planter reagerer på skiftende miljøer 2,5.
RSA registrerer varierende næringsstofkoncentrationer og gør fænotypiske ændringer 4,6,7,8,9,10,11,12. Undersøgelser tyder på, at rodmorfologi/RSA er meget plastisk sammenlignet med skudmorfologi 1,3. RSA-egenskabskortlægning er yderst effektiv til registrering af effekten af at ændre det omgivende jordmiljø 1,11,12.
Generelt er uoverensstemmelser i effekten af forskellige næringsstofmangler på rodfænotypen blevet rapporteret i mange tidligere undersøgelser 3,11,13,14,15. For eksempel er der flere kontrasterende rapporter om fosfat (Pi) sultinducerede ændringer i antallet, længden og densiteten af laterale rødder (LR’er). Der er rapporteret om en stigning i LR-tætheden under pi-mangelfuld tilstand 6,8. I modsætning hertil er et fald i LR-tætheden under Pi-mangelfulde forhold også blevet rapporteret af andre forfattere 3,13,16. En af de fremtrædende årsager til disse uoverensstemmelser er brugen af det elementære forureningsudsatte geleringsmedium, som agar ofte indeholder10. Forskere dyrker typisk deres eksperimentelle planter på et agarbaseret pladesystem og registrerer rodegenskaberne. Talrige RSA-egenskaber er ofte skjult eller forankret i agarmaterialet og kan ikke dokumenteres. Eksperimenter forbundet med inducerende næringsstofmangel, hvor brugere ofte udelukker en komponent helt fra mediet, kan ikke udføres i geleringsmedium med tendens til elementær forurening11,14,15. Talrige næringsstoffer er ofte til stede i betydelige mængder i agarmedierne, herunder P, Zn, Fe og mange flere11,14,15. Desuden er RSA-væksten langsommere i agarbaserede medier end i ikke-agarbaseret flydende medium. Som følge heraf er der behov for at etablere en alternativ ikke-agarbaseret tilgang til kvantificering og kvalitativ registrering af fænotypen af RSA. Derfor er den nuværende metode blevet udviklet, hvor plantlets opdrættes i et magenta boxbaseret hydroponisk system oven på et polypropylennet understøttet af polycarbonatkiler 1,10,11.
Denne undersøgelse præsenterer en detaljeret improviseret version af den tidligere metode beskrevet af Jain et al.10. Denne strategi er tilpasset de aktuelle krav inden for planterodsbiologi og kan også bruges til planter som lucerne, bortset fra modelplanter. Protokollen er den primære måde at måle ændringerne i RSA på, og den kræver kun simpelt udstyr. Denne protokol illustrerer, hvordan man fænotype flere rodfunktioner, såsom primære og laterale rødder i normalt og modificeret medium (Pi-mangel). Trinvise anvisninger og andre nyttige tip hentet fra forfatterens erfaringer leveres for at hjælpe forskerne med at følge med de metoder, der tilbydes i denne metode. Denne undersøgelse har til formål at give en enkel og effektiv metode til at afsløre hele rodsystemet af planter, herunder LR’er af højere orden. Denne metode involverer manuel spredning af rodsystemet med en rund akvarel kunstbørste, hvilket giver mulighed for præcis kontrol over eksponeringen af rødderne 1,10,11,12. Det kræver ikke dyrt udstyr eller kompliceret software. Denne metode har forbedret næringsstofoptagelse og vækstrate; Planter har en næringsrig opløsning, der let absorberes af deres rødder. Den nuværende metode er velegnet til forskere, der ønsker at kortlægge egenskaberne ved en plantes rodsystem i detaljer, især under tidlig udvikling (10-15 dage efter spiring). Det er velegnet til små rodsystemer, modelplanter som Arabidopsis og tobak og ikke-konventionelle planter som lucerne, indtil deres rodsystem passer i magentakasserne.
Trinene til fænotypisk analyse af RSA-udviklingen i Arabidopsis er skitseret i denne protokol som følger: (1) metoden til frøoverfladesterilisering for planter (Arabidopsis), (2) trinene til oprettelse af det hydroponiske system, efterfulgt af frøsåning på et medium, (3) procedure for udtagning af de komplette såninger og spredning på petripladen til RSA-analyse, (4) hvordan man optager billederne til RSA, og (5) beregner vigtige RSA-parametre ved hjælp af ImageJ-software.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette arbejde demonstrerede kortlægning af RSA ved hjælp af simpelt laboratorieudstyr. Ved hjælp af denne metode registreres fænotypiske ændringer på det raffinerede niveau. Fordelen ved denne strategi er, at skuddelen aldrig kommer i kontakt med medierne, så fænotypen af plantene er original. Denne metode indebærer oprettelse af et hydroponisk system til dyrkning af planter som beskrevet i protokollen. Derefter tages hver plante intakt ud og placeres på en agarfyldt petriplade. Rotsystemet får derefter lov ti…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender U.S. Department of Agriculture (Grant 58-6406-1-017) for at støtte denne forskning. Vi anerkender også WKU Biotechnology Centre, Western Kentucky University, Bowling Green, KY, USA, og direktøren, CSIR Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, Lucknow, Indien, for at levere instrumentfaciliteterne og support (CSIR CIMAP manuskriptmeddelelse nr. CIMAP / PUB / 2022/103). SS anerkender den økonomiske støtte fra Saint Joseph’s University, Philadelphia, USA.
Materials
| Arabidospsis thaliana (Col 0) | Lehle Seeds | WT-02 | Columbia (Col-0**, no markers)* |
| Art brushes | Amazon or any other vendor | Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm) | |
| Automated Microscope with digital camera | Leica Microsystems | LAS version 4.12.0, Leica Microsystems | |
| Imaging Software | ImageJ | ImageJ V 1.8.0 |
|
| Magenta box GA-7 | Fisher Scientific | 50-255-176 | |
| Medicago sativa | Johnny's Seeds | ||
| Petri-plate (150 mm x 15 mm) | USA Scientific | 8609-0215 | 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com) |
| Photo camera | Cannon or Nikon | Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode | |
| Plant-Agar | Sigma-Aldrich | A3301 | Agargel Suitable for plant tissue culture |
| Polycarbonate Sheets | Amazon | 1 mm thick | |
| Polypropylene Mesh | Amazon | Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm | |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi) |
References
- Shukla, D., Rinehart, C. A., Sahi, S. V. Comprehensive study of excess phosphate response reveals ethylene mediated signaling that negatively regulates plant growth and development. Scientific Reports. 7 (1), 3074 (2017).
- Rellán-Álvarez, R., Lobet, G., Dinneny, J. R. Environmental control of root system biology. Annual Review of Plant Biology. 67, 619-642 (2016).
- Gruber, B. D., Giehl, R. F. H., Friedel, S., von Wirén, N. Plasticity of the Arabidopsis root system under nutrient deficiencies. Plant Physiology. 163 (1), 161-179 (2013).
- Shukla, D., et al. Genome-wide expression analysis reveals contrasting regulation of phosphate starvation response (PSR) in root and shoot of Arabidopsis and its association with biotic stress. Environmental and Experimental Botany. , 188 (2021).
- Robbins 2nd, ., E, N., Dinneny, J. R. Growth is required for perception of water availability to pattern root branches in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), E822-E831 (2018).
- Linkohr, B. I., Williamson, L. C., Fitter, A. H., Leyser, H. M. O. Nitrate and phosphate availability and distribution have different effects on root system architecture of Arabidopsis. The Plant Journal. 29 (6), 751-760 (2002).
- Lynch, J. P., Brown, K. M. Topsoil foraging: an architectural adaptation of plants to low phosphorus availability. Plant and Soil. 237 (2), 225-237 (2001).
- López-Bucio, J., et al. Phosphate availability alters architecture and causes changes in hormone sensitivity in the Arabidopsis root system. Plant Physiology. 129 (1), 244-256 (2002).
- Jain, A., et al. Differential effects of sucrose and auxin on localized phosphate deficiency-induced modulation of different traits of root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 144 (1), 232-247 (2007).
- Jain, A., et al. Variations in the composition of gelling agents affect morphophysiological and molecular responses to deficiencies of phosphate and other nutrients. Plant Physiology. 150 (2), 1033-1049 (2009).
- Jain, A., Sinilal, B., Dhandapani, G., Meagher, R. B., Sahi, S. V. Effects of deficiency and excess of zinc on morphophysiological traits and spatiotemporal regulation of zinc-responsive genes reveal incidence of cross talk between micro- and macronutrients. Environmental Science and Technology. 47 (10), 5327-5335 (2013).
- Jain, A., et al. Role of Fe-responsive genes in bioreduction and transport of ionic gold to roots of Arabidopsis thaliana during synthesis of gold nanoparticles. Plant Physiology and Biochemistry. 84, 189-196 (2014).
- Williamson, L. C., Ribrioux, S. P., Fitter, A. H., Leyser, H. M. Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 126 (2), 875-882 (2001).
- Yang, T. J. W., Lin, W. D., Schmidt, W. Transcriptional profiling of the Arabidopsis iron deficiency response reveals conserved transition metal homeostasis networks. Plant Physiology. 152 (4), 2130 (2010).
- Kobae, Y., et al. Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis. Plant Cell and Physiology. 45 (12), (2004).
- Al-Ghazi, Y., et al. Temporal responses of Arabidopsis root architecture to phosphate starvation: evidence for the involvement of auxin signalling. Plant, Cell and Environment. 26 (7), 1053-1066 (2003).
- S, U. . National Institutes of Health. , 1997-2007 (1997).
- Dubrovsky, J. G., Forde, B. G. Quantitative analysis of lateral root development: pitfalls and how to avoid them. The Plant Cell. 24 (1), 4-14 (2012).
- Weeks, J. T., Ye, J., Rommens, C. M. Development of an in planta method for transformation of Alfalfa (Medicago sativa). Transgenic Research. 17 (4), 587-597 (2008).
- Shukla, D., Krishnamurthy, S., Sahi, S. V. Microarray analysis of Arabidopsis under gold exposure to identify putative genes involved in the synthesis of gold nanoparticles (AuNPs).Genomics Data. 3, 100-102 (2015).
