प्लांट रूट सिस्टम आर्किटेक्चर लक्षणों के मानचित्रण के लिए एक सरल प्रोटोकॉल
Summary
हम एराबिडोप्सिस और मेडिकागो के रूट सिस्टम आर्किटेक्चर (आरएसए) की जांच करने के लिए सरल प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करते हैं। प्लांटलेट्स को जाल पर हाइड्रोपोनिक रूप से उगाया जाता है और आरएसए को प्रकट करने के लिए एक कला ब्रश का उपयोग करके फैलाया जाता है। छवियों को स्कैनिंग या उच्च-रिज़ॉल्यूशन कैमरे का उपयोग करके लिया जाता है, फिर लक्षणों को मैप करने के लिए इमेजजे के साथ विश्लेषण किया जाता है।
Abstract
पौधों की जड़ प्रणाली वास्तुकला (आरएसए) विकास का व्यापक ज्ञान पोषक तत्वों के उपयोग की दक्षता में सुधार और पर्यावरणीय चुनौतियों के लिए फसल खेती सहिष्णुता बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है। हाइड्रोपोनिक सिस्टम, प्लांटलेट ग्रोथ, आरएसए प्रसार और इमेजिंग की स्थापना के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। दृष्टिकोण ने पॉली कार्बोनेट वेज द्वारा समर्थित पॉलीप्रोपाइलीन जाल युक्त एक मैजेंटा बॉक्स-आधारित हाइड्रोपोनिक प्रणाली का उपयोग किया। प्रयोगात्मक सेटिंग्स को अलग-अलग पोषक तत्वों (फॉस्फेट [पीआई]) आपूर्ति के तहत प्लांटलेट्स के आरएसए का आकलन करके उदाहरण दिया जाता है। इस प्रणाली को एराबिडोप्सिस के आरएसए की जांच करने के लिए स्थापित किया गया था, लेकिन यह मेडिकागो सैटिवा (अल्फाल्फा ) जैसे अन्य पौधों का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलनीय है। एराबिडोप्सिस थैलियाना (कोल -0) प्लांटलेट का उपयोग इस जांच में पौधे आरएसए को समझने के लिए एक उदाहरण के रूप में किया जाता है। इथेनॉल और पतला वाणिज्यिक ब्लीच का इलाज करके बीजों को सतह निष्फल किया जाता है, और स्तरीकरण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है। बीज पॉली कार्बोनेट वेज द्वारा समर्थित पॉलीप्रोपाइलीन जाल पर तरल आधे एमएस माध्यम पर अंकुरित और उगाए जाते हैं। पौधों को वांछित दिनों के लिए मानक विकास स्थितियों के तहत उगाया जाता है, धीरे से जाल से उठाया जाता है, और पानी युक्त आगर प्लेटों में डुबोया जाता है। प्लांटलेट्स की प्रत्येक जड़ प्रणाली को एक गोल कला ब्रश की मदद से पानी से भरी प्लेट पर धीरे से फैलाया जाता है। आरएसए लक्षणों को दस्तावेज करने के लिए इन पेट्री प्लेटों को उच्च रिज़ॉल्यूशन पर फोटो या स्कैन किया जाता है। मूल लक्षण, जैसे प्राथमिक जड़, पार्श्व जड़ें और शाखा क्षेत्र, स्वतंत्र रूप से उपलब्ध इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मापा जाता है। यह अध्ययन नियंत्रित पर्यावरण सेटिंग्स में पौधे की जड़ विशेषताओं को मापने के लिए तकनीक प्रदान करता है। हम चर्चा करते हैं कि (1) प्लांटलेट कैसे उगाए जाएं, और जड़ के नमूने एकत्र और प्रसारित करें, (2) फैले हुए आरएसए नमूनों की तस्वीरें प्राप्त करें, (3) छवियों को कैप्चर करें, और (4) जड़ विशेषताओं को निर्धारित करने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। वर्तमान विधि का लाभ आरएसए लक्षणों का बहुमुखी, आसान और कुशल माप है।
Introduction
रूट सिस्टम आर्किटेक्चर (आरएसए), जो भूमिगत है, पौधे के विकास और उत्पादकता 1,2,3 के लिए एक महत्वपूर्ण अंग है। भ्रूण चरण के बाद, पौधे अपने सबसे महत्वपूर्ण रूपात्मक परिवर्तनों से गुजरते हैं। जिस तरह से मिट्टी में जड़ें बढ़ती हैं, वह जमीन के ऊपर पौधों के हिस्सों के विकास को बहुत प्रभावित करती है। जड़ विकास अंकुरण में पहला कदम है। यह एक सूचनात्मक विशेषता है क्योंकि यह विशिष्ट रूप से विभिन्न उपलब्ध पोषक तत्वों 1,2,3,4 का जवाब देता है। आरएसए विकासात्मक प्लास्टिसिटी की एक उच्च डिग्री प्रदर्शित करता है, जिसका अर्थ है कि पर्यावरण का उपयोग हमेशा विकासके बारे में निर्णय लेने के लिए किया जाता है 2,5। पर्यावरण में परिवर्तन ने वर्तमान परिदृश्य में फसल उत्पादन को और अधिक कठिन बना दिया है। निरंतर आधार पर, आरएसए पर्यावरणीय संकेतों को विकासात्मक विकल्पों में शामिल करताहै। नतीजतन, जड़ विकास के पीछे सिद्धांतों की पूरी तरह से समझ यह सीखने के लिए आवश्यक है कि पौधे बदलते वातावरण2,5 का जवाब कैसे देते हैं।
आरएसए अलग-अलग पोषक तत्व सांद्रता को महसूस करता है और फेनोटाइपिक परिवर्तन 4,6,7,8,9,10,11,12 प्रदान करता है। अध्ययनों से पता चलता है कि शूट आकृति विज्ञान 1,3 की तुलना में जड़ आकृति विज्ञान / आरएसए अत्यधिक प्लास्टिक है। आरएसए विशेषता मानचित्रण आसपास के मिट्टी के वातावरण को बदलने के प्रभाव को रिकॉर्ड करने में अत्यधिक प्रभावी है 1,11,12.
सामान्य तौर पर, रूट फेनोटाइप पर विभिन्न पोषक तत्वों की कमी के प्रभाव में विसंगतियों को कई पहले के अध्ययनों 3,11,13,14,15 में रिपोर्ट किया गया है। उदाहरण के लिए, पार्श्व जड़ों (एलआर) की संख्या, लंबाई और घनत्व में फॉस्फेट (पीआई) भुखमरी-प्रेरित परिवर्तनों पर कई विपरीत रिपोर्टें हैं। पाई की कमी की स्थिति 6,8 के तहत एलआर घनत्व में वृद्धि की सूचना दी गई है। इसके विपरीत, पाई की कमी की स्थिति के तहत एलआर घनत्व में कमी अन्य लेखकों 3,13,16 द्वारा भी रिपोर्ट की गई है। इन विसंगतियों के प्रमुख कारणों में से एक मौलिक संदूषण-प्रवण गेलिंग माध्यम का उपयोग है, जिसमें अक्सर10 होते हैं। शोधकर्ता आमतौर पर अपने प्रयोगात्मक पौधों को एगर-आधारित प्लेट प्रणाली पर उगाते हैं और जड़ लक्षणों को रिकॉर्ड करते हैं। कई आरएसए लक्षण अक्सर एगर सामग्री के भीतर छिपे या घुसे होते हैं और उन्हें प्रलेखित नहीं किया जा सकता है। पोषक तत्वों की कमी को प्रेरित करने से जुड़े प्रयोग, जिसमें उपयोगकर्ता अक्सर माध्यम से एक घटक को पूरी तरह से बाहर कर देते हैं, मौलिक संदूषण-प्रवण गेलिंग माध्यम 11,14,15 में नहीं किया जा सकता है। कई पोषक तत्व अक्सर आगर मीडिया में महत्वपूर्ण मात्रा में मौजूद होते हैं, जिनमें पी, जेडएन, एफई और कई और 11,14,15 शामिल हैं। इसके अलावा, गैर-आगर-आधारित तरल माध्यम की तुलना में एगर-आधारित मीडिया में आरएसए की वृद्धि धीमी है। नतीजतन, आरएसए के फेनोटाइप को निर्धारित करने और गुणात्मक रूप से रिकॉर्ड करने के लिए एक वैकल्पिक गैर-आगर-आधारित दृष्टिकोण स्थापित करने की आवश्यकता है। नतीजतन, वर्तमान विधि विकसित की गई है, जिसमें प्लांटलेट को पॉली कार्बोनेट वेज1,10,11 द्वारा समर्थित पॉलीप्रोपाइलीन जाल के ऊपर एक मैजेंटा बॉक्स-आधारित हाइड्रोपोनिक सिस्टम में उठाया जाता है।
यह अध्ययन जैन एट अल.10 द्वारा वर्णित पहले की विधि का एक विस्तृत तात्कालिक संस्करण प्रस्तुत करता है। इस रणनीति को पौधे की जड़ जीव विज्ञान में वर्तमान मांगों के लिए ट्यून किया गया है और इसका उपयोग मॉडल पौधों के अलावा अल्फाल्फा जैसे पौधों के लिए भी किया जा सकता है। प्रोटोकॉल आरएसए में परिवर्तनों को मापने का प्राथमिक तरीका है, और इसके लिए केवल सरल उपकरणों की आवश्यकता होती है। वर्तमान प्रोटोकॉल दिखाता है कि सामान्य और संशोधित माध्यम (पाई की कमी) में प्राथमिक और पार्श्व जड़ों जैसे कई मूल विशेषताओं को कैसे फेनोटाइप किया जाए। लेखक के अनुभवों से प्राप्त चरण-दर-चरण निर्देश और अन्य उपयोगी संकेत शोधकर्ताओं को इस पद्धति में दी गई पद्धतियों के साथ पालन करने में मदद करने के लिए प्रदान किए जाते हैं। वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य पौधों की पूरी जड़ प्रणाली को प्रकट करने के लिए एक सरल और प्रभावी विधि प्रदान करना है, जिसमें उच्च क्रम एलआर भी शामिल हैं। इस विधि में एक गोल वॉटरकलर आर्ट ब्रश के साथ रूट सिस्टम को मैन्युअल रूप से फैलाना शामिल है, जिससे जड़ों 1,10,11,12 के संपर्क पर सटीक नियंत्रण की अनुमति मिलती है। इसके लिए महंगे उपकरण या जटिल सॉफ्टवेयर की आवश्यकता नहीं है। इस विधि ने पोषक तत्वों के उत्थान और विकास दर में सुधार किया है; पौधों में पोषक तत्वों से भरपूर घोल होता है जो उनकी जड़ों द्वारा आसानी से अवशोषित होता है। वर्तमान विधि उन शोधकर्ताओं के लिए उपयुक्त है जो पौधे की जड़ प्रणाली के लक्षणों को विस्तार से मैप करना चाहते हैं, खासकर प्रारंभिक विकास के दौरान (अंकुरण के 10-15 दिन बाद)। यह छोटे जड़ प्रणालियों, एराबिडोप्सिस और तंबाकू जैसे मॉडल पौधों और अल्फाल्फा जैसे गैर-पारंपरिक पौधों के लिए उपयुक्त है जब तक कि उनकी जड़ प्रणाली मैजेंटा बक्से में फिट नहीं होती है।
एराबिडोप्सिस में आरएसए विकास के फेनोटाइपिक विश्लेषण के चरणों को इस प्रोटोकॉल में निम्नानुसार रेखांकित किया गया है: (1) पौधों (एराबिडोप्सिस) के लिए बीज की सतह नसबंदी की विधि, (2) हाइड्रोपोनिक प्रणाली स्थापित करने के चरण, इसके बाद एक माध्यम पर बीज बुवाई, (3) आरएसए विश्लेषण के लिए पेट्री प्लेट पर पूर्ण बीज लेने और फैलने की प्रक्रिया। (4) आरएसए के लिए छवियों को कैसे रिकॉर्ड करें, और (5) इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके महत्वपूर्ण आरएसए मापदंडों की गणना करें।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस काम ने सरल प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करके आरएसए मानचित्रण का प्रदर्शन किया। इस विधि का उपयोग करके, फेनोटाइपिक परिवर्तन परिष्कृत स्तर पर दर्ज किए जाते हैं। इस रणनीति का लाभ यह है कि शूट भाग कभी भी म…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस शोध का समर्थन करने के लिए अमेरिकी कृषि विभाग (अनुदान 58-6406-1-017) को स्वीकार करते हैं। हम डब्ल्यूकेयू जैव प्रौद्योगिकी केंद्र, वेस्टर्न केंटकी विश्वविद्यालय, बॉलिंग ग्रीन, केवाई, यूएसए और निदेशक, सीएसआईआर सेंट्रल इंस्टीट्यूट ऑफ मेडिसिनल एंड एरोमैटिक प्लांट्स, लखनऊ, भारत को उपकरण सुविधाएं और सहायता प्रदान करने के लिए भी स्वीकार करते हैं (सीएसआईआर सीमैप पांडुलिपि संचार संख्या सीआईएमएपी / पीयूबी / 2022/103)। एसएस सेंट जोसेफ विश्वविद्यालय, फिलाडेल्फिया, संयुक्त राज्य अमेरिका से वित्तीय सहायता स्वीकार करता है।
Materials
| Arabidospsis thaliana (Col 0) | Lehle Seeds | WT-02 | Columbia (Col-0**, no markers)* |
| Art brushes | Amazon or any other vendor | Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm) | |
| Automated Microscope with digital camera | Leica Microsystems | LAS version 4.12.0, Leica Microsystems | |
| Imaging Software | ImageJ | ImageJ V 1.8.0 |
|
| Magenta box GA-7 | Fisher Scientific | 50-255-176 | |
| Medicago sativa | Johnny's Seeds | ||
| Petri-plate (150 mm x 15 mm) | USA Scientific | 8609-0215 | 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com) |
| Photo camera | Cannon or Nikon | Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode | |
| Plant-Agar | Sigma-Aldrich | A3301 | Agargel Suitable for plant tissue culture |
| Polycarbonate Sheets | Amazon | 1 mm thick | |
| Polypropylene Mesh | Amazon | Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm | |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi) |
References
- Shukla, D., Rinehart, C. A., Sahi, S. V. Comprehensive study of excess phosphate response reveals ethylene mediated signaling that negatively regulates plant growth and development. Scientific Reports. 7 (1), 3074 (2017).
- Rellán-Álvarez, R., Lobet, G., Dinneny, J. R. Environmental control of root system biology. Annual Review of Plant Biology. 67, 619-642 (2016).
- Gruber, B. D., Giehl, R. F. H., Friedel, S., von Wirén, N. Plasticity of the Arabidopsis root system under nutrient deficiencies. Plant Physiology. 163 (1), 161-179 (2013).
- Shukla, D., et al. Genome-wide expression analysis reveals contrasting regulation of phosphate starvation response (PSR) in root and shoot of Arabidopsis and its association with biotic stress. Environmental and Experimental Botany. , 188 (2021).
- Robbins 2nd, ., E, N., Dinneny, J. R. Growth is required for perception of water availability to pattern root branches in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), E822-E831 (2018).
- Linkohr, B. I., Williamson, L. C., Fitter, A. H., Leyser, H. M. O. Nitrate and phosphate availability and distribution have different effects on root system architecture of Arabidopsis. The Plant Journal. 29 (6), 751-760 (2002).
- Lynch, J. P., Brown, K. M. Topsoil foraging: an architectural adaptation of plants to low phosphorus availability. Plant and Soil. 237 (2), 225-237 (2001).
- López-Bucio, J., et al. Phosphate availability alters architecture and causes changes in hormone sensitivity in the Arabidopsis root system. Plant Physiology. 129 (1), 244-256 (2002).
- Jain, A., et al. Differential effects of sucrose and auxin on localized phosphate deficiency-induced modulation of different traits of root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 144 (1), 232-247 (2007).
- Jain, A., et al. Variations in the composition of gelling agents affect morphophysiological and molecular responses to deficiencies of phosphate and other nutrients. Plant Physiology. 150 (2), 1033-1049 (2009).
- Jain, A., Sinilal, B., Dhandapani, G., Meagher, R. B., Sahi, S. V. Effects of deficiency and excess of zinc on morphophysiological traits and spatiotemporal regulation of zinc-responsive genes reveal incidence of cross talk between micro- and macronutrients. Environmental Science and Technology. 47 (10), 5327-5335 (2013).
- Jain, A., et al. Role of Fe-responsive genes in bioreduction and transport of ionic gold to roots of Arabidopsis thaliana during synthesis of gold nanoparticles. Plant Physiology and Biochemistry. 84, 189-196 (2014).
- Williamson, L. C., Ribrioux, S. P., Fitter, A. H., Leyser, H. M. Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 126 (2), 875-882 (2001).
- Yang, T. J. W., Lin, W. D., Schmidt, W. Transcriptional profiling of the Arabidopsis iron deficiency response reveals conserved transition metal homeostasis networks. Plant Physiology. 152 (4), 2130 (2010).
- Kobae, Y., et al. Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis. Plant Cell and Physiology. 45 (12), (2004).
- Al-Ghazi, Y., et al. Temporal responses of Arabidopsis root architecture to phosphate starvation: evidence for the involvement of auxin signalling. Plant, Cell and Environment. 26 (7), 1053-1066 (2003).
- S, U. . National Institutes of Health. , 1997-2007 (1997).
- Dubrovsky, J. G., Forde, B. G. Quantitative analysis of lateral root development: pitfalls and how to avoid them. The Plant Cell. 24 (1), 4-14 (2012).
- Weeks, J. T., Ye, J., Rommens, C. M. Development of an in planta method for transformation of Alfalfa (Medicago sativa). Transgenic Research. 17 (4), 587-597 (2008).
- Shukla, D., Krishnamurthy, S., Sahi, S. V. Microarray analysis of Arabidopsis under gold exposure to identify putative genes involved in the synthesis of gold nanoparticles (AuNPs).Genomics Data. 3, 100-102 (2015).
