플랜트 루트 시스템 아키텍처 특성을 매핑하기 위한 간단한 프로토콜
Summary
우리는 간단한 실험실 도구를 사용하여 Arabidopsis 및 Medicago의 루트 시스템 아키텍처 (RSA)를 검사합니다. 묘목은 메쉬 위에 수경 재배되고 아트 브러시를 사용하여 RSA를 드러냅니다. 스캐닝 또는 고해상도 카메라를 사용하여 이미지를 촬영한 다음 ImageJ로 분석하여 특성을 매핑합니다.
Abstract
식물 뿌리 시스템 아키텍처(RSA) 개발에 대한 포괄적인 지식은 영양소 사용 효율성을 개선하고 환경 문제에 대한 작물 재배 내성을 높이는 데 매우 중요합니다. 수경 재배 시스템, 묘목 성장, RSA 확산 및 이미징을 설정하기 위한 실험 프로토콜이 제시됩니다. 이 접근법은 폴리 카보네이트 쐐기로 지지되는 폴리프로필렌 메쉬를 포함하는 마젠타 상자 기반 수경 재배 시스템을 사용했습니다. 실험 설정은 다양한 영양소(인산염[Pi]) 공급 하에서 묘목의 RSA를 평가하여 예시됩니다. 이 시스템은 애기장대의 RSA를 조사하기 위해 설립되었지만 Medicago sativa (알팔파)와 같은 다른 식물을 연구하는 데 쉽게 적응할 수 있습니다. 애기장대( Col-0) 묘목은 식물 RSA를 이해하기 위한 예로 이 조사에서 사용됩니다. 종자는 에탄올 및 희석된 상업용 표백제를 처리하여 표면 멸균하고, 성층화를 위해 4°C에서 보관한다. 종자는 발아되어 폴리 카보네이트 쐐기로 지지되는 폴리프로필렌 메쉬의 액체 하프 MS 배지에서 자랍니다. 묘목은 원하는 일 수 동안 표준 성장 조건에서 재배되고 메쉬에서 부드럽게 골라내어 물이 함유 된 한천 플레이트에 담근다. 묘목의 각 뿌리 계통은 둥근 아트 브러시를 사용하여 물이 채워진 판에 부드럽게 펼쳐집니다. 이 페트리 플레이트는 RSA 특성을 문서화하기 위해 고해상도로 촬영하거나 스캔합니다. 1차 뿌리, 측면 뿌리 및 분기 영역과 같은 뿌리 특성은 무료로 제공되는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정됩니다. 이 연구는 통제된 환경 환경에서 식물 뿌리 특성을 측정하는 기술을 제공합니다. (1) 묘목을 재배하고, 뿌리 샘플을 수집 및 퍼뜨리고, (2) 퍼진 RSA 샘플의 사진을 얻고, (3) 이미지를 캡처하고, (4) 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 뿌리 속성을 정량화하는 방법에 대해 논의합니다. 본 방법의 장점은 RSA 형질의 다양하고 쉽고 효율적인 측정입니다.
Introduction
지하에 있는 루트 시스템 아키텍처(RSA)는 식물 성장과 생산성 1,2,3을 위한 중요한 기관입니다. 배아 단계 후에 식물은 가장 중요한 형태 학적 변화를 겪습니다. 뿌리가 토양에서 자라는 방식은 땅 위의 식물 부분의 성장에 큰 영향을 미칩니다. 뿌리 성장은 발아의 첫 번째 단계입니다. 그것은 다른 이용 가능한 영양소 1,2,3,4에 독특하게 반응하기 때문에 유익한 특성입니다. RSA는 높은 수준의 발달 가소성을 나타내며, 이는 환경이 항상 개발 2,5에 대한 결정을 내리는 데 사용된다는 것을 의미합니다. 환경의 변화로 인해 현재 시나리오에서 작물 생산이 더욱 어려워졌습니다. RSA는 지속적으로 환경 신호를 개발 선택에 통합합니다5. 결과적으로 뿌리 발달의 원리에 대한 철저한 이해는 식물이 변화하는 환경에 어떻게 반응하는지 배우는 데 필수적입니다 2,5.
RSA는 다양한 영양소 농도를 감지하고 표현형 변화를 4,6,7,8,9,10,11,12로 만듭니다. 연구에 따르면 뿌리 형태/RSA는 싹 형태 1,3에 비해 매우 가소성이 높습니다. RSA 형질 맵핑은 주변 토양 환경 변화의 효과를 기록하는 데 매우 효과적이다 1,11,12.
일반적으로, 뿌리 표현형에 대한 다양한 영양소 결핍의 효과의 불일치는 많은 초기 연구에서 보고되었습니다 3,11,13,14,15. 예를 들어, 인산염(Pi) 기아로 인한 측근(LR)의 수, 길이 및 밀도 변화에 대한 몇 가지 대조적인 보고서가 있습니다. LR 밀도의 증가는 Pi 결핍 조건 6,8에서 보고되었습니다. 대조적으로, Pi 결핍 조건 하에서 LR 밀도의 감소는 다른 저자 3,13,16에 의해서도보고되었다. 이러한 불일치의 두드러진 원인 중 하나는 원소 오염이 발생하기 쉬운 겔화 배지를 사용하는 것인데, 한천에는 종종10개가 포함되어 있습니다. 연구원들은 일반적으로 한천 기반 플레이트 시스템에서 실험 식물을 재배하고 뿌리 특성을 기록합니다. 수많은 RSA 형질이 한천 물질 내에 숨겨져 있거나 굳어지는 경우가 많으며 문서화할 수 없습니다. 영양 결핍 유도와 관련된 실험은 사용자가 종종 배지에서 한 성분을 완전히 배제하는 것으로, 원소 오염이 발생하기 쉬운 겔화 배지11,14,15에서 수행할 수 없다. 수많은 영양소가 한천 배지에 상당한 양으로 존재하는 경우가 많으며, 여기에는 P, Zn, Fe 등이포함된다 11,14,15. 또한, RSA 성장은 한천 기반이 아닌 액체 배지보다 한천 기반 배지에서 더 느립니다. 그 결과, RSA의 표현형을 정량화하고 정성적으로 기록하기 위한 대안적인 비한천 기반 접근법을 확립할 필요가 있다. 결과적으로, 폴리카보네이트 쐐기 1,10,11에 의해 지지되는 폴리프로필렌 메쉬 위에 자홍색 상자 기반 수경재배 시스템에서 묘목을 키우는 현재의 방법이 개발되었습니다.
이 연구는 Jain et al.10에 의해 기술된 이전 방법의 상세한 즉석 버전을 제시한다. 이 전략은 식물 뿌리 생물학의 현재 요구에 맞게 조정되었으며 모델 식물 이외의 알팔파와 같은 식물에도 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 RSA의 변경 사항을 측정하는 주요 방법이며 간단한 장비만 있으면 됩니다. 본 프로토콜은 정상 및 변형된 배지(Pi 결핍)에서 1차 및 외측 뿌리와 같은 여러 뿌리 특징을 표현형화하는 방법을 보여줍니다. 저자의 경험에서 얻은 단계별 지침과 기타 유용한 힌트는 연구자들이 이 방법에서 제공되는 방법론을 따르는 데 도움이 되도록 제공됩니다. 본 연구는 고차 LR을 포함하여 식물의 전체 뿌리 시스템을 밝히기 위한 간단하고 효과적인 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다. 이 방법은 둥근 수채화 아트 브러시로 루트 시스템을 수동으로 펼치면 루트 1,10,11,12의 노출을 정밀하게 제어할 수 있습니다. 고가의 장비나 복잡한 소프트웨어가 필요하지 않습니다. 이 방법은 영양소 흡수와 성장률을 향상시켰습니다. 식물은 뿌리에 쉽게 흡수되는 영양이 풍부한 용액을 가지고 있습니다. 본 방법은 특히 초기 발달 (발아 후 10-15 일) 동안 식물의 뿌리 시스템의 특성을 자세히 매핑하고자하는 연구자에게 적합합니다. 작은 뿌리 시스템, 애기장대 및 담배와 같은 모델 식물, 뿌리 시스템이 자홍색 상자에 들어갈 때까지 알팔파와 같은 비전통적인 식물에 적합합니다.
애기장대에서 RSA 발달의 표현형 분석 단계는 다음과 같이 이 프로토콜에 요약되어 있습니다: (1) 식물(Arabidopsis)에 대한 종자 표면 살균 방법, (2) 수경 재배 시스템을 설정하는 단계, 배지에 종자 파종, (3) RSA 분석을 위해 완전한 파종을 꺼내 페트리 플레이트에 뿌리는 절차, (4) RSA용 이미지를 기록하는 방법, (5) ImageJ 소프트웨어를 사용하여 중요한 RSA 매개변수를 계산합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 작업에서는 간단한 실험실 장비를 사용하여 RSA를 매핑하는 방법을 시연했습니다. 이 방법을 사용하면 표현형 변경이 정제 된 수준에서 기록됩니다. 이 전략의 이점은 싹 부분이 미디어와 접촉하지 않기 때문에 묘목의 표현형이 독창적이라는 것입니다. 이 방법은 프로토콜에 설명 된대로 묘목을 재배하기 위해 수경 재배 시스템을 설정하는 것을 포함합니다. 그런 다음 각 묘목을 그대로 꺼내 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구를 지원해 주신 미국 농무부(보조금 58-6406-1-017)에 감사드립니다. 우리는 또한 미국 켄터키주 볼링 그린에 있는 Western Kentucky University의 WKU 생명공학 센터와 기기 시설 및 지원을 제공한 인도 러크나우에 있는 CSIR Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants의 소장에게 감사드립니다(CSIR CIMAP 원고 통신 번호 CIMAP/PUB/2022/103). SS는 미국 필라델피아에 있는 Saint Joseph’s University의 재정 지원을 인정합니다.
Materials
| Arabidospsis thaliana (Col 0) | Lehle Seeds | WT-02 | Columbia (Col-0**, no markers)* |
| Art brushes | Amazon or any other vendor | Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm) | |
| Automated Microscope with digital camera | Leica Microsystems | LAS version 4.12.0, Leica Microsystems | |
| Imaging Software | ImageJ | ImageJ V 1.8.0 |
|
| Magenta box GA-7 | Fisher Scientific | 50-255-176 | |
| Medicago sativa | Johnny's Seeds | ||
| Petri-plate (150 mm x 15 mm) | USA Scientific | 8609-0215 | 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com) |
| Photo camera | Cannon or Nikon | Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode | |
| Plant-Agar | Sigma-Aldrich | A3301 | Agargel Suitable for plant tissue culture |
| Polycarbonate Sheets | Amazon | 1 mm thick | |
| Polypropylene Mesh | Amazon | Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm | |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi) |
References
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