En enkel protokoll for kartlegging av plantens rotsystemarkitekturegenskaper

Summary

Vi bruker enkle laboratorieverktøy for å undersøke rotsystemarkitekturen (RSA) til Arabidopsis og Medicago. Plantene dyrkes hydroponisk over netting og spres med en kunstpensel for å avsløre RSA. Bildene tas ved hjelp av skanning eller et høyoppløselig kamera, og analyseres deretter med ImageJ for å kartlegge egenskaper.

Abstract

Omfattende kunnskap om utvikling av planterotsystemarkitektur (RSA) er avgjørende for å forbedre effektiviteten av næringsbruken og øke avlingskultivartoleransen for miljøutfordringer. En eksperimentell protokoll presenteres for å sette opp det hydroponiske systemet, plantevekst, RSA-spredning og avbildning. Tilnærmingen brukte et magenta boksbasert hydroponisk system som inneholder polypropylennett støttet av polykarbonatkiler. Eksperimentelle innstillinger eksemplifiseres ved å vurdere RSA for plantene under varierende næringstilførsel (fosfat [Pi]). Systemet ble etablert for å undersøke RSA av Arabidopsis, men det er lett tilpasningsdyktig å studere andre planter som Medicago sativa (Alfalfa). Arabidopsis thaliana (Col-0) plantetter brukes i denne undersøkelsen som et eksempel for å forstå planten RSA. Frøene overflatesteriliseres ved behandling av etanol og fortynnet kommersielt blekemiddel, og holdes ved 4 °C for stratifisering. Frøene spires og dyrkes på et flytende halv-MS-medium på et polypropylennett støttet av polykarbonatkiler. Plantene dyrkes under standard vekstforhold i ønsket antall dager, plukkes forsiktig ut fra nettet og nedsenkes i vannholdige agarplater. Hvert rotsystem av plantlets spres forsiktig på den vannfylte platen ved hjelp av en rund kunstbørste. Disse petriskålene fotograferes eller skannes i høy oppløsning for å dokumentere RSA-egenskapene. Rotegenskapene, som primærrot, laterale røtter og forgreningssone, måles ved hjelp av den fritt tilgjengelige ImageJ-programvaren. Denne studien gir teknikker for å måle planterotegenskaper i kontrollerte miljøinnstillinger. Vi diskuterer hvordan vi kan (1) dyrke plantene, og samle og spre rotprøver, (2) få bilder av oppspredte RSA-prøver, (3) ta bildene, og (4) bruke bildeanalyseprogramvare for å kvantifisere rotattributter. Fordelen med den nåværende metoden er den allsidige, enkle og effektive målingen av RSA-egenskapene.

Introduction

Rotsystemarkitekturen (RSA), som er under jorden, er et viktig organ for plantevekst og produktivitet ^1,2,3. Etter embryonale scenen gjennomgår planter sine mest signifikante morfologiske forandringer. Måten røttene vokser i jorda på, påvirker i stor grad veksten av plantedeler over bakken. Rotvekst er det første trinnet i spiring. Det er en informativ egenskap da den unikt reagerer på forskjellige tilgjengelige næringsstoffer 1,2,3,4. RSA utviser en høy grad av utviklingsplastisitet, noe som betyr at miljøet alltid brukes til å ta beslutninger om utvikling ^2,5. Endringer i miljøet har gjort avlingene vanskeligere i det nåværende scenariet. Kontinuerlig inkorporerer RSA miljøsignaler i utviklingsvalg⁵. Som et resultat er en grundig forståelse av prinsippene bak rotutvikling avgjørende for å lære hvordan planter reagerer på skiftende miljøer ^2,5.

RSA registrerer varierende næringsstoffkonsentrasjoner og gjengir fenotypiske endringer 4,6,7,8,9,10,11,12. Studier tyder på at rotmorfologi/RSA er svært plastisk sammenlignet med skuddmorfologi ^1,3. RSA egenskapskartlegging er svært effektiv for å registrere effekten av å endre det omkringliggende jordmiljøet 1,11,12.

Generelt er avvik i effekten av ulike næringsdefekter på rotfenotypen rapportert i mange tidligere studier 3,11,13,14,15. For eksempel er det flere kontrasterende rapporter om fosfat (Pi) sult-induserte endringer i antall, lengde og tetthet av laterale røtter (LR). Det er rapportert en økning i LR-tettheten under Pi-mangelbetingelsen ^6,8. I motsetning til dette har en reduksjon i LR-tetthet under Pi-mangelfulle forhold også blitt rapportert av andre forfattere 3,13,16. En av de fremtredende årsakene til disse inkonsekvensene er bruken av det elementære forurensningsutsatte geleringsmediet, som agar ofte inneholder¹⁰. Forskere vokser vanligvis sine eksperimentelle planter på et agarbasert platesystem og registrerer rotegenskapene. Mange RSA-trekk er ofte skjult eller forankret i agarmaterialet og kan ikke dokumenteres. Eksperimenter knyttet til å indusere næringsmangel, der brukere ofte utelukker en komponent helt fra mediet, kan ikke utføres i elementær forurensningsutsatt geleringsmedium^11,14,15. Tallrike næringsstoffer er ofte til stede i betydelige mengder i agarmediet, inkludert P, Zn, Fe og mange flere^11,14,15. Videre er RSA-veksten langsommere i agarbaserte medier enn i ikke-agarbasert flytende medium. Som et resultat er det behov for å etablere en alternativ ikke-agarbasert tilnærming for å kvantifisere og kvalitativt registrere fenotypen av RSA. Følgelig er den nåværende metoden utviklet, der plantetter heves i et magenta boksbasert hydroponisk system på toppen av et polypropylennett støttet av polykarbonatkiler 1,10,11.

Denne studien presenterer en detaljert improvisert versjon av den tidligere metoden beskrevet av Jain et ^al.10. Denne strategien har blitt innstilt for dagens krav i planterotbiologi og kan også brukes til planter som Alfalfa, annet enn modellplanter. Protokollen er den primære måten å måle endringene i RSA, og den krever bare enkelt utstyr. Den foreliggende protokollen illustrerer hvordan man kan fenotype flere rottrekk, for eksempel primære og laterale røtter i normalt og modifisert medium (Pi mangelfull). Trinnvise instruksjoner og andre nyttige tips hentet fra forfatterens erfaringer er gitt for å hjelpe forskerne til å følge med metodene som tilbys i denne metoden. Denne studien tar sikte på å gi en enkel og effektiv metode for å avsløre hele rotsystemet av planter, inkludert høyere ordens LR. Denne metoden innebærer å manuelt spre rotsystemet med en rund akvarellkunstpensel, noe som gir presis kontroll over eksponeringen av røttene 1,10,11,12. Det krever ikke dyrt utstyr eller komplisert programvare. Denne metoden har forbedret næringsopptak og veksthastighet; Planter har en næringsrik løsning som lett absorberes av sine røtter. Dagens metode passer for forskere som ønsker å kartlegge egenskapene til en plantes rotsystem i detalj, spesielt under tidlig utvikling (10-15 dager etter spiring). Den er egnet for små rotsystemer, modellplanter som Arabidopsis og tobakk, og ikke-konvensjonelle planter som Alfalfa til rotsystemet passer i magenta-boksene.

Trinnene for fenotypisk analyse av RSA-utvikling i Arabidopsis er skissert i denne protokollen som følger: (1) metoden for frøoverflatesterilisering for planter (Arabidopsis), (2) trinnene for å sette opp det hydroponiske systemet, etterfulgt av frøsåing på et medium, (3) prosedyre for å ta ut de komplette såingene og spre seg på petriskålen for RSA-analyse, (4) hvordan du tar opp bildene for RSA, og (5) beregner viktige RSA-parametere ved hjelp av ImageJ-programvare.

Protocol

Hele protokollen er oppsummert skjematisk i figur 1, og viser alle de essensielle trinnene som er involvert i å avsløre rotsystemarkitekturen (RSA) til plantlets. Protokolltrinnene er gitt i detalj nedenfor: 1. Arabidopsis frøoverflatesterilisering Overfør en liten skje (ca. 100 frø = ca. 2,5 mg) frø til et mikrofugerør, og suge i 30 minutter i destillert vann ved romtemperatur (RT). Hele denne prosedyren utføres i aseptisk tilst…

Representative Results

De ulike morfometriske egenskapene til rotsystemarkitektur (RSA) måles med enkle laboratorieverktøy, og trinnene er skjematisk avbildet i figur 1. Detaljene i det hydroponiske oppsettet demonstrerer protokollens potensial for måling av RSA (figur 1 og figur 2). Gitt de observerte forskjellene i geleringsmidler, brukte vi et hydroponisk vekstsystem for å gjennomføre alle studiene</su…

Discussion

Dette arbeidet demonstrerte kartlegging av RSA ved hjelp av enkelt laboratorieutstyr. Ved hjelp av denne metoden registreres fenotypiske endringer på raffinert nivå. Fordelen med denne strategien er at skudddelen aldri kommer i kontakt med media, så fenotypen til plantene er original. Denne metoden innebærer å sette opp et hydroponisk system for å dyrke plantlets som beskrevet i protokollen. Deretter blir hver plante tatt ut intakt og plassert på en agarfylt petriskallerken. Rotsystemet får deretter lov til å sp…

Materials

Arabidospsis thaliana (Col 0)	Lehle Seeds	WT-02	Columbia (Col-0**, no markers)*
Art brushes	Amazon or any other vendor		Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm)
Automated Microscope with digital camera	Leica Microsystems		LAS version 4.12.0, Leica Microsystems
Imaging Software	ImageJ		ImageJ V  1.8.0
Magenta box GA-7	Fisher Scientific	50-255-176
Medicago sativa	Johnny's Seeds
Petri-plate (150 mm x 15 mm)	USA Scientific	8609-0215	150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com)
Photo camera	Cannon or Nikon		Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode
Plant-Agar	Sigma-Aldrich	A3301	Agargel  Suitable for plant tissue culture
Polycarbonate Sheets	Amazon		1 mm  thick
Polypropylene Mesh	Amazon		Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm
Scanner	Epson		Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi)