Um Protocolo Simples para Mapear as Características da Arquitetura do Sistema Radicular da Planta
Summary
Usamos ferramentas laboratoriais simples para examinar a arquitetura do sistema radicular (RSA) de Arabidopsis e Medicago. As plântulas são cultivadas hidroponicamente sobre malha e espalhadas usando um pincel de arte para revelar a RSA. As imagens são tiradas usando digitalização ou uma câmera de alta resolução e, em seguida, analisadas com o ImageJ para mapear traços.
Abstract
O conhecimento abrangente do desenvolvimento da arquitetura do sistema radicular das plantas (RSA) é fundamental para melhorar a eficiência do uso de nutrientes e aumentar a tolerância das cultivares aos desafios ambientais. Um protocolo experimental é apresentado para a montagem do sistema hidropônico, crescimento de plântulas, disseminação da ASR e obtenção de imagens. A abordagem utilizou um sistema hidropônico à base de caixa magenta contendo tela de polipropileno suportada por cunhas de policarbonato. Os cenários experimentais são exemplificados pela avaliação da ASR das plântulas sob oferta variável de nutrientes (fosfato [Pi]). O sistema foi estabelecido para examinar a ASR de Arabidopsis, mas é facilmente adaptável para estudar outras plantas como Medicago sativa (Alfafa). As plântulas de Arabidopsis thaliana (Col-0) são utilizadas nesta investigação como exemplo para o entendimento da planta RSA. As sementes são esterilizadas superficialmente por tratamento com etanol e água sanitária comercial diluída e mantidas a 4 °C para estratificação. As sementes são germinadas e cultivadas em meio líquido semi-MS sobre tela de polipropileno suportada por cunhas de policarbonato. As plântulas são cultivadas sob condições padrão de crescimento para o número desejado de dias, delicadamente retiradas da malha e submersas em placas de ágar contendo água. Cada sistema radicular das plântulas é espalhado suavemente na placa cheia de água com a ajuda de um pincel de arte redondo. Essas placas de Petri são fotografadas ou digitalizadas em alta resolução para documentar as características da RSA. As características radiculares, como raiz primária, raízes laterais e zona de ramificação, são medidas usando o software ImageJ disponível gratuitamente. Este estudo fornece técnicas para medir as características radiculares de plantas em ambientes controlados. Nós discutimos como (1) cultivar as plântulas, coletar e espalhar amostras de raízes, (2) obter fotos de amostras de RSA espalhadas, (3) capturar as imagens e (4) usar software de análise de imagens para quantificar atributos radiculares. A vantagem do presente método é a medição versátil, fácil e eficiente das características da ASR.
Introduction
A arquitetura do sistema radicular (ASR), que é subterrânea, é um órgão vital para o crescimento e produtividade das plantas 1,2,3. Após o estágio embrionário, as plantas sofrem suas alterações morfológicas mais significativas. A maneira como as raízes crescem no solo afeta muito o crescimento das partes das plantas acima do solo. O crescimento radicular é o primeiro passo para a germinação. É uma característica informativa, pois responde de forma única aos diferentes nutrientes disponíveis 1,2,3,4. A ASR apresenta alto grau de plasticidade desenvolvimental, o que significa que o ambiente é sempre utilizado para tomar decisões sobre o desenvolvimento 2,5. As mudanças no ambiente têm dificultado a produção agrícola no cenário atual. De forma contínua, a ASR incorpora sinais ambientais nas escolhas de desenvolvimento5. Como resultado, uma compreensão completa dos princípios por trás do desenvolvimento radicular é essencial para aprender como as plantas respondem às mudanças em ambientes 2,5.
A ASR detecta concentrações variáveis de nutrientes e produz alterações fenotípicas 4,6,7,8,9,10,11,12. Estudos sugerem que a morfologia radicular/ASR é altamente plástica em comparação com a morfologia da parteaérea1,3. O mapeamento das características da ASR é altamente eficaz no registro do efeito da alteração do ambiente do solo circundante 1,11,12.
Em geral, discrepâncias no efeito de várias deficiências de nutrientes sobre o fenótipo radicular foram relatadas em muitos estudos anteriores 3,11,13,14,15. Por exemplo, há vários relatos contrastantes sobre mudanças induzidas pela fome de fosfato (Pi) no número, comprimento e densidade das raízes laterais (RLs). Um aumento na densidade de RV tem sido relatado sob a condição de deficiência de Pi 6,8. Em contraste, uma diminuição na densidade de RV em condições deficientes de Pi também foi relatada por outros autores 3,13,16. Uma das causas proeminentes dessas inconsistências é o uso do meio gelificante propenso à contaminação elementar, que o ágar geralmente contém10. Os pesquisadores normalmente cultivam suas plantas experimentais em um sistema de placas à base de ágar e registram as características radiculares. Numerosas características da ASR são frequentemente ocultadas ou entrincheiradas dentro do material de ágar e não podem ser documentadas. Experimentos ligados à indução de deficiência de nutrientes, nos quais os usuários frequentemente excluem totalmente um componente do meio, não podem ser realizados em meios gelificantes propensos à contaminação elementar11,14,15. Numerosos nutrientes estão frequentemente presentes em quantidades significativas no meio ágar, incluindo P, Zn, Fe e muitos outros11,14,15. Além disso, o crescimento da ASR é mais lento em meios à base de ágar do que em meios líquidos não baseados em ágar. Como resultado, há necessidade de estabelecer uma abordagem alternativa não baseada em ágar para quantificar e registrar qualitativamente o fenótipo da ASR. Consequentemente, o método atual tem sido desenvolvido, no qual as plântulas são levantadas em um sistema hidropônico à base de caixa magenta sobre uma tela de polipropileno suportada por cunhas de policarbonato 1,10,11.
Este estudo apresenta uma versão improvisada detalhada do método anterior descrito por Jain et al.10. Esta estratégia foi ajustada para as demandas atuais em biologia radicular de plantas e também pode ser usada para plantas como a alfafa, além de plantas modelo. O protocolo é a principal forma de medir as mudanças na ASR, e requer apenas equipamentos simples. O presente protocolo ilustra como fenotipar diversas características radiculares, como raízes primárias e laterais em meio normal e modificado (Pi deficiente). Instruções passo a passo e outras dicas úteis colhidas das experiências do autor são fornecidas para ajudar os pesquisadores a seguir as metodologias oferecidas neste método. O presente estudo tem como objetivo fornecer um método simples e eficaz para revelar todo o sistema radicular das plantas, incluindo as LRs de ordem superior. Este método consiste em espalhar manualmente o sistema radicular com um pincel redondo em aquarela, permitindo um controle preciso sobre a exposição das raízes 1,10,11,12. Não requer equipamentos caros ou softwares complicados. Este método melhorou a absorção de nutrientes e a taxa de crescimento; As plantas têm uma solução rica em nutrientes facilmente absorvida por suas raízes. O presente método é adequado para pesquisadores que desejam mapear detalhadamente as características do sistema radicular de uma planta, particularmente durante o desenvolvimento inicial (10-15 dias após a germinação). É adequado para pequenos sistemas radiculares, plantas modelo como Arabidopsis e tabaco, e plantas não convencionais como alfafa até que seu sistema radicular caiba nas caixas magenta.
As etapas para a análise fenotípica do desenvolvimento da ASR em Arabidopsis são descritas neste protocolo da seguinte forma: (1) o método de esterilização da superfície das sementes para plantas (Arabidopsis), (2) as etapas para a instalação do sistema hidropônico, seguido da semeadura das sementes em um meio, (3) o procedimento para retirar as plântulas completas e espalhar na placa de Petri para análise da ASR, (4) como gravar as imagens para RSA e (5) calcular parâmetros importantes de RSA usando o software ImageJ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabalho demonstrou o mapeamento da ASR utilizando equipamentos laboratoriais simples. Usando este método, as alterações fenotípicas são registradas no nível refinado. O benefício dessa estratégia é que a parte aérea nunca entra em contato com a mídia, de modo que o fenótipo das plântulas é original. Este método envolve a criação de um sistema hidropônico para o cultivo de plântulas, conforme descrito no protocolo. Em seguida, cada plântula é retirada intacta e colocada em uma placa de Petri che…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Departamento de Agricultura dos EUA (Grant 58-6406-1-017) pelo apoio a esta pesquisa. Também agradecemos ao WKU Biotechnology Centre, Western Kentucky University, Bowling Green, KY, EUA, e ao Diretor do CSIR Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, Lucknow, Índia, por fornecer as instalações e o suporte do instrumento (CSIR CIMAP manuscript communication no. CIMAP/PUB/2022/103). A SS agradece o apoio financeiro da Saint Joseph’s University, Filadélfia, EUA.
Materials
| Arabidospsis thaliana (Col 0) | Lehle Seeds | WT-02 | Columbia (Col-0**, no markers)* |
| Art brushes | Amazon or any other vendor | Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm) | |
| Automated Microscope with digital camera | Leica Microsystems | LAS version 4.12.0, Leica Microsystems | |
| Imaging Software | ImageJ | ImageJ V 1.8.0 |
|
| Magenta box GA-7 | Fisher Scientific | 50-255-176 | |
| Medicago sativa | Johnny's Seeds | ||
| Petri-plate (150 mm x 15 mm) | USA Scientific | 8609-0215 | 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com) |
| Photo camera | Cannon or Nikon | Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode | |
| Plant-Agar | Sigma-Aldrich | A3301 | Agargel Suitable for plant tissue culture |
| Polycarbonate Sheets | Amazon | 1 mm thick | |
| Polypropylene Mesh | Amazon | Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm | |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi) |
References
- Shukla, D., Rinehart, C. A., Sahi, S. V. Comprehensive study of excess phosphate response reveals ethylene mediated signaling that negatively regulates plant growth and development. Scientific Reports. 7 (1), 3074 (2017).
- Rellán-Álvarez, R., Lobet, G., Dinneny, J. R. Environmental control of root system biology. Annual Review of Plant Biology. 67, 619-642 (2016).
- Gruber, B. D., Giehl, R. F. H., Friedel, S., von Wirén, N. Plasticity of the Arabidopsis root system under nutrient deficiencies. Plant Physiology. 163 (1), 161-179 (2013).
- Shukla, D., et al. Genome-wide expression analysis reveals contrasting regulation of phosphate starvation response (PSR) in root and shoot of Arabidopsis and its association with biotic stress. Environmental and Experimental Botany. , 188 (2021).
- Robbins 2nd, ., E, N., Dinneny, J. R. Growth is required for perception of water availability to pattern root branches in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), E822-E831 (2018).
- Linkohr, B. I., Williamson, L. C., Fitter, A. H., Leyser, H. M. O. Nitrate and phosphate availability and distribution have different effects on root system architecture of Arabidopsis. The Plant Journal. 29 (6), 751-760 (2002).
- Lynch, J. P., Brown, K. M. Topsoil foraging: an architectural adaptation of plants to low phosphorus availability. Plant and Soil. 237 (2), 225-237 (2001).
- López-Bucio, J., et al. Phosphate availability alters architecture and causes changes in hormone sensitivity in the Arabidopsis root system. Plant Physiology. 129 (1), 244-256 (2002).
- Jain, A., et al. Differential effects of sucrose and auxin on localized phosphate deficiency-induced modulation of different traits of root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 144 (1), 232-247 (2007).
- Jain, A., et al. Variations in the composition of gelling agents affect morphophysiological and molecular responses to deficiencies of phosphate and other nutrients. Plant Physiology. 150 (2), 1033-1049 (2009).
- Jain, A., Sinilal, B., Dhandapani, G., Meagher, R. B., Sahi, S. V. Effects of deficiency and excess of zinc on morphophysiological traits and spatiotemporal regulation of zinc-responsive genes reveal incidence of cross talk between micro- and macronutrients. Environmental Science and Technology. 47 (10), 5327-5335 (2013).
- Jain, A., et al. Role of Fe-responsive genes in bioreduction and transport of ionic gold to roots of Arabidopsis thaliana during synthesis of gold nanoparticles. Plant Physiology and Biochemistry. 84, 189-196 (2014).
- Williamson, L. C., Ribrioux, S. P., Fitter, A. H., Leyser, H. M. Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 126 (2), 875-882 (2001).
- Yang, T. J. W., Lin, W. D., Schmidt, W. Transcriptional profiling of the Arabidopsis iron deficiency response reveals conserved transition metal homeostasis networks. Plant Physiology. 152 (4), 2130 (2010).
- Kobae, Y., et al. Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis. Plant Cell and Physiology. 45 (12), (2004).
- Al-Ghazi, Y., et al. Temporal responses of Arabidopsis root architecture to phosphate starvation: evidence for the involvement of auxin signalling. Plant, Cell and Environment. 26 (7), 1053-1066 (2003).
- S, U. . National Institutes of Health. , 1997-2007 (1997).
- Dubrovsky, J. G., Forde, B. G. Quantitative analysis of lateral root development: pitfalls and how to avoid them. The Plant Cell. 24 (1), 4-14 (2012).
- Weeks, J. T., Ye, J., Rommens, C. M. Development of an in planta method for transformation of Alfalfa (Medicago sativa). Transgenic Research. 17 (4), 587-597 (2008).
- Shukla, D., Krishnamurthy, S., Sahi, S. V. Microarray analysis of Arabidopsis under gold exposure to identify putative genes involved in the synthesis of gold nanoparticles (AuNPs).Genomics Data. 3, 100-102 (2015).
