Ett enkelt protokoll för kartläggning av växtrotsystemets arkitekturegenskaper
Summary
Vi använder enkla laboratorieverktyg för att undersöka rotsystemarkitekturen (RSA) hos Arabidopsis och Medicago. Plantorna odlas hydroponiskt över nät och sprids med en konstborste för att avslöja RSA. Bilder tas med skanning eller en högupplöst kamera och analyseras sedan med ImageJ för att kartlägga egenskaper.
Abstract
Omfattande kunskap om utveckling av växtrotsystemarkitektur (RSA) är avgörande för att förbättra effektiviteten i näringsanvändningen och öka grödans odlingstolerans mot miljöutmaningar. Ett experimentellt protokoll presenteras för att inrätta det hydroponiska systemet, växttillväxt, RSA-spridning och avbildning. Tillvägagångssättet använde ett magentaboxbaserat hydroponiskt system innehållande polypropennät som stöds av polykarbonatkilar. Experimentella inställningar exemplifieras genom att bedöma plantlets RSA under varierande näringstillförsel (fosfat [Pi]). Systemet inrättades för att undersöka RSA av Arabidopsis, men det är lätt anpassningsbart att studera andra växter som Medicago sativa (Alfalfa). Arabidopsis thaliana (Col-0) plantor används i denna undersökning som ett exempel för att förstå växtens RSA. Frön ytsteriliseras genom behandling av etanol och utspädd kommersiell blekmedel och hålls vid 4 °C för skiktning. Fröna groddar och odlas på ett flytande halv-MS-medium på ett polypropennät som stöds av polykarbonatkilar. Plantorna odlas under standardtillväxtförhållanden under önskat antal dagar, plockas försiktigt ut från nätet och nedsänks i vatteninnehållande agarplattor. Varje rotsystem av plantorna sprids försiktigt på den vattenfyllda plattan med hjälp av en rund konstborste. Dessa Petri-plattor fotograferas eller skannas med hög upplösning för att dokumentera RSA-egenskaperna. Rotegenskaperna, såsom primärrot, laterala rötter och förgreningszon, mäts med hjälp av den fritt tillgängliga ImageJ-programvaran. Denna studie ger tekniker för att mäta växtrotegenskaper i kontrollerade miljöinställningar. Vi diskuterar hur man (1) odlar plantorna och samlar in och sprider rotprover, (2) får bilder av spridda RSA-prover, (3) fångar bilderna och (4) använder bildanalysprogramvara för att kvantifiera rotattribut. Fördelen med den nuvarande metoden är den mångsidiga, enkla och effektiva mätningen av RSA-egenskaperna.
Introduction
Rotsystemarkitekturen (RSA), som är underjordisk, är ett viktigt organ för växttillväxt och produktivitet 1,2,3. Efter embryonalstadiet genomgår växterna sina mest signifikanta morfologiska förändringar. Det sätt på vilket rötterna växer i jorden påverkar i hög grad tillväxten av växtdelar ovan jord. Rottillväxt är det första steget i spiring. Det är ett informativt drag eftersom det unikt svarar på olika tillgängliga näringsämnen 1,2,3,4. RSA uppvisar en hög grad av utvecklingsplasticitet, vilket innebär att miljön alltid används för att fatta beslut om utveckling 2,5. Förändringar i miljön har försvårat växtproduktionen i det nuvarande scenariot. RSA införlivar kontinuerligt miljösignaler i utvecklingsval5. Som ett resultat är en grundlig förståelse av principerna bakom rotutveckling avgörande för att lära sig hur växter svarar på förändrade miljöer 2,5.
RSA känner av varierande näringskoncentrationer och gör fenotypiska förändringar 4,6,7,8,9,10,11,12. Studier tyder på att rotmorfologi/RSA är mycket plastisk jämfört med skottmorfologi 1,3. RSA-egenskapskartläggning är mycket effektiv för att registrera effekten av att förändra den omgivande markmiljön 1,11,12.
I allmänhet har skillnader i effekten av olika näringsbrister på rotfenotypen rapporterats i många tidigare studier 3,11,13,14,15. Till exempel finns det flera kontrasterande rapporter om fosfat (Pi) svältinducerade förändringar i antal, längd och densitet av laterala rötter (LR). En ökning av LR-densiteten har rapporterats under Pi-bristvillkoret 6,8. Däremot har en minskning av LR-densiteten under Pi-bristfälliga förhållanden också rapporterats av andra författare 3,13,16. En av de främsta orsakerna till dessa inkonsekvenser är användningen av det elementära föroreningsbenägna gelningsmediet, vilket agar ofta innehåller10. Forskare odlar vanligtvis sina experimentella växter på ett agarbaserat plattsystem och registrerar rotegenskaperna. Många RSA-egenskaper är ofta dolda eller förankrade i agarmaterialet och kan inte dokumenteras. Experiment kopplade till inducerande näringsbrist, där användare ofta utesluter en komponent helt från mediet, kan inte utföras i elementärt kontamineringsbenägen gelningsmedium11,14,15. Många näringsämnen finns ofta i betydande mängder i agarmediet, inklusive P, Zn, Fe och många fler11,14,15. Dessutom är RSA-tillväxten långsammare i agarbaserade medier än i icke-agarbaserade flytande medium. Som ett resultat finns det ett behov av att fastställa ett alternativt icke-agarbaserat tillvägagångssätt för kvantifiering och kvalitativ registrering av fenotypen av RSA. Följaktligen har den nuvarande metoden utvecklats, där plantor odlas i ett magentaboxbaserat hydroponiskt system ovanpå ett polypropennät som stöds av polykarbonatkilar 1,10,11.
Denna studie presenterar en detaljerad improviserad version av den tidigare metoden som beskrivs av Jain et al.10. Denna strategi har anpassats för nuvarande krav inom växtrotbiologi och kan också användas för växter som Alfalfa, andra än modellväxter. Protokollet är det primära sättet att mäta förändringarna i RSA, och det kräver bara enkel utrustning. Detta protokoll illustrerar hur man fenotypar flera rotfunktioner, såsom primära och laterala rötter i normalt och modifierat medium (Pi-brist). Steg-för-steg-anvisningar och andra användbara tips från författarens erfarenheter tillhandahålls för att hjälpa forskarna att följa med de metoder som erbjuds i denna metod. Den aktuella studien syftar till att ge en enkel och effektiv metod för att avslöja hela växtsystemets rotsystem, inklusive högre ordningens LR. Denna metod innebär att man manuellt sprider rotsystemet med en rund akvarellkonstborste, vilket möjliggör exakt kontroll över exponeringen av rötterna 1,10,11,12. Det kräver inte dyr utrustning eller komplicerad programvara. Denna metod har förbättrat näringsupptag och tillväxthastighet; Växter har en näringsrik lösning som lätt absorberas av sina rötter. Den nuvarande metoden är lämplig för forskare som vill kartlägga egenskaperna hos en växts rotsystem i detalj, särskilt under tidig utveckling (10-15 dagar efter groning). Den är lämplig för små rotsystem, modellväxter som Arabidopsis och tobak och icke-konventionella växter som Alfalfa tills deras rotsystem passar i magentalådorna.
Stegen för fenotypisk analys av RSA-utveckling i Arabidopsis beskrivs i detta protokoll enligt följande: (1) metoden för sterilisering av fröytan för växter (Arabidopsis), (2) stegen för att inrätta det hydroponiska systemet, följt av sådd av utsäde på ett medium, (3) förfarande för att ta ut hela sådden och sprida på Petri-plattan för RSA-analys, (4) hur man spelar in bilderna för RSA, och (5) beräkna viktiga RSA-parametrar med hjälp av ImageJ-programvaran.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta arbete demonstrerade kartläggning av RSA med hjälp av enkel laboratorieutrustning. Med hjälp av denna metod registreras fenotypiska förändringar på raffinerad nivå. Fördelen med denna strategi är att skottdelen aldrig kommer i kontakt med media, så fenotypen hos plantorna är original. Denna metod innebär att man inrättar ett hydroponiskt system för att odla plantor som beskrivs i protokollet. Därefter tas varje planta ut intakt och placeras på en agarfylld petriska. Rotsystemet får sedan spridas ma…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner US Department of Agriculture (Grant 58-6406-1-017) för att stödja denna forskning. Vi erkänner också WKU Biotechnology Centre, Western Kentucky University, Bowling Green, KY, USA, och direktören, CSIR Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, Lucknow, Indien, för att ha tillhandahållit instrumentfaciliteter och support (CSIR CIMAP manuskriptmeddelande nr. CIMAP/PUB/2022/103). SS erkänner det ekonomiska stödet från Saint Joseph’s University, Philadelphia, USA.
Materials
| Arabidospsis thaliana (Col 0) | Lehle Seeds | WT-02 | Columbia (Col-0**, no markers)* |
| Art brushes | Amazon or any other vendor | Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm) | |
| Automated Microscope with digital camera | Leica Microsystems | LAS version 4.12.0, Leica Microsystems | |
| Imaging Software | ImageJ | ImageJ V 1.8.0 |
|
| Magenta box GA-7 | Fisher Scientific | 50-255-176 | |
| Medicago sativa | Johnny's Seeds | ||
| Petri-plate (150 mm x 15 mm) | USA Scientific | 8609-0215 | 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com) |
| Photo camera | Cannon or Nikon | Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode | |
| Plant-Agar | Sigma-Aldrich | A3301 | Agargel Suitable for plant tissue culture |
| Polycarbonate Sheets | Amazon | 1 mm thick | |
| Polypropylene Mesh | Amazon | Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm | |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi) |
References
- Shukla, D., Rinehart, C. A., Sahi, S. V. Comprehensive study of excess phosphate response reveals ethylene mediated signaling that negatively regulates plant growth and development. Scientific Reports. 7 (1), 3074 (2017).
- Rellán-Álvarez, R., Lobet, G., Dinneny, J. R. Environmental control of root system biology. Annual Review of Plant Biology. 67, 619-642 (2016).
- Gruber, B. D., Giehl, R. F. H., Friedel, S., von Wirén, N. Plasticity of the Arabidopsis root system under nutrient deficiencies. Plant Physiology. 163 (1), 161-179 (2013).
- Shukla, D., et al. Genome-wide expression analysis reveals contrasting regulation of phosphate starvation response (PSR) in root and shoot of Arabidopsis and its association with biotic stress. Environmental and Experimental Botany. , 188 (2021).
- Robbins 2nd, ., E, N., Dinneny, J. R. Growth is required for perception of water availability to pattern root branches in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), E822-E831 (2018).
- Linkohr, B. I., Williamson, L. C., Fitter, A. H., Leyser, H. M. O. Nitrate and phosphate availability and distribution have different effects on root system architecture of Arabidopsis. The Plant Journal. 29 (6), 751-760 (2002).
- Lynch, J. P., Brown, K. M. Topsoil foraging: an architectural adaptation of plants to low phosphorus availability. Plant and Soil. 237 (2), 225-237 (2001).
- López-Bucio, J., et al. Phosphate availability alters architecture and causes changes in hormone sensitivity in the Arabidopsis root system. Plant Physiology. 129 (1), 244-256 (2002).
- Jain, A., et al. Differential effects of sucrose and auxin on localized phosphate deficiency-induced modulation of different traits of root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 144 (1), 232-247 (2007).
- Jain, A., et al. Variations in the composition of gelling agents affect morphophysiological and molecular responses to deficiencies of phosphate and other nutrients. Plant Physiology. 150 (2), 1033-1049 (2009).
- Jain, A., Sinilal, B., Dhandapani, G., Meagher, R. B., Sahi, S. V. Effects of deficiency and excess of zinc on morphophysiological traits and spatiotemporal regulation of zinc-responsive genes reveal incidence of cross talk between micro- and macronutrients. Environmental Science and Technology. 47 (10), 5327-5335 (2013).
- Jain, A., et al. Role of Fe-responsive genes in bioreduction and transport of ionic gold to roots of Arabidopsis thaliana during synthesis of gold nanoparticles. Plant Physiology and Biochemistry. 84, 189-196 (2014).
- Williamson, L. C., Ribrioux, S. P., Fitter, A. H., Leyser, H. M. Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 126 (2), 875-882 (2001).
- Yang, T. J. W., Lin, W. D., Schmidt, W. Transcriptional profiling of the Arabidopsis iron deficiency response reveals conserved transition metal homeostasis networks. Plant Physiology. 152 (4), 2130 (2010).
- Kobae, Y., et al. Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis. Plant Cell and Physiology. 45 (12), (2004).
- Al-Ghazi, Y., et al. Temporal responses of Arabidopsis root architecture to phosphate starvation: evidence for the involvement of auxin signalling. Plant, Cell and Environment. 26 (7), 1053-1066 (2003).
- S, U. . National Institutes of Health. , 1997-2007 (1997).
- Dubrovsky, J. G., Forde, B. G. Quantitative analysis of lateral root development: pitfalls and how to avoid them. The Plant Cell. 24 (1), 4-14 (2012).
- Weeks, J. T., Ye, J., Rommens, C. M. Development of an in planta method for transformation of Alfalfa (Medicago sativa). Transgenic Research. 17 (4), 587-597 (2008).
- Shukla, D., Krishnamurthy, S., Sahi, S. V. Microarray analysis of Arabidopsis under gold exposure to identify putative genes involved in the synthesis of gold nanoparticles (AuNPs).Genomics Data. 3, 100-102 (2015).
