Hurtig myokardie- og hjerteafslapning er afgørende for normal fysiologi. Mekaniske afslapningsmekanismer er nu kendt for at være afhængige af belastningshastighed. Denne protokol giver et overblik over erhvervelse og analyse af eksperimenter for yderligere at studere den mekaniske kontrol af afslapning.
Diastolisk dysfunktion er en almindelig fænotype på tværs af præsentationer af hjerte-kar-sygdomme. Ud over forhøjet hjertestivhed (forhøjet venstre ventrikulært slutdiastolisk tryk) er nedsat hjerteafslapning en vigtig diagnostisk indikator for diastolisk dysfunktion. Mens afslapning kræver fjernelse af cytosolisk calcium og deaktivering af sarkomeriske tynde filamenter, har målretning af sådanne mekanismer endnu ikke givet effektive behandlinger. Mekaniske mekanismer, såsom blodtryk (dvs. efterbelastning), er blevet teoretiseret for at ændre afslapning. For nylig viste vi, at ændring af belastningshastigheden for en strækning, ikke efterbelastning, var både nødvendig og tilstrækkelig til at ændre den efterfølgende afslapningshastighed for myokardievæv. Belastningshastighedsafhængigheden af afslapning, kaldet mekanisk kontrol af afslapning (MCR), kan vurderes ved hjælp af intakte hjertetrabeculae. Denne protokol beskriver udarbejdelsen af en smådyrsmodel, forsøgssystem og kammer, isolering af hjertet og efterfølgende isolering af en trabecula, forberedelse af forsøgskammeret samt forsøgs- og analyseprotokoller. Beviser for forlængelse af stammer i det intakte hjerte tyder på, at MCR kan give nye arenaer for bedre karakterisering af farmakologiske behandlinger sammen med en metode til vurdering af myofilamentkinetik i intakte muskler. Derfor kan undersøgelse af MCR belyse en vej til nye tilgange og nye grænser i behandlingen af hjertesvigt.
Hjerteafslapning er nedsat i næsten alle former for hjertesvigt (herunder hjertesvigt med reduceret udstødningsfraktion) og i mange hjerte-kar-sygdomme. Ud over adskillige metoder til evaluering af hjertefunktion i permeabiliserede muskler vinder evalueringen af intakte hjertemuskler interesse. Sådanne væv vurderes, aflæsses (ender frit at trække sig sammen) eller belastes (længde eller kraft kontrolleres). Historisk set er intakte isolerede myocytter blevet evalueret i en ubelastet tilstand, hvor cellekroppen er fri til at forkorte under sammentrækning. Intakte hjertetrabeculae evalueres ofte under isometriske forhold, hvor længden ikke må ændre sig, men stress (kraft pr. Tværsnitsareal) genereres. Både intakte myocyt- og trabeculae-metoder begynder at konvergere med modifikationer af belastning 1,2.
Protokoller til belastningsklemme af en muskel (dvs. styring af en muskels udviklede stress ved en bestemt værdi, der simulerer fysiologiske efterbelastninger) er blevet udviklet over flere årtier 3,4,5. I intakt hjertevæv giver belastningsklemmer forskere mulighed for bedre at efterligne in vivo-hjertecyklussen ved hjælp af isotoniske eller Windkessel-lignende efterbelastninger 6,7,8,9. Målet med denne protokol er at opnå data, der anvendes til at kvantificere MCR (dvs. belastningshastighedsafhængigheden af lempelseshastigheden)8,9.
Mens MCR-protokollen er blevet tilpasset fra tidligere arbejde, er fokus for denne protokol (sammenlignet med lignende protokoller, der bruger intakt hjertevæv) på biomekaniske mekanismer, der ændrer afslapning. Der er flere protokoller, der bruger belastningsspænding 3,4,5,7,10 og protokoller med fokus på Windkessel-modeller 1,2,11, men denne protokol beskriver specifikt, hvordan strækning før afslapning ændrer afslapningshastigheden. Vi har vist, at denne kontrol forekommer i en proto-diastolisk periode8, en fase oprindeligt beskrevet af Wiggers12. I normale sunde hjerter gennemgår myokardiet en forlængende belastning under udstødning før aortaklappelukning (dvs. før isovolumisk afslapning)13. Dette efterlignes ved at forlænge varigheden af efterbelastningskontrol, indtil musklen begynder at strække sig. Klinisk dokumentation tyder på, at denne forlængelse kan svækkes eller gå tabt i sygdomstilstande14, og implikationerne og mekanismerne af ændrede endesystoliske belastningshastigheder er ikke blevet fuldt belyst. I betragtning af de sparsomme behandlingsmuligheder for diastoliske sygdomme og hjertesvigt med en bevaret uddrivningsfraktion postulerer vi, at MCR kan give indsigt i nye mekanismer, der ligger til grund for nedsat afslapning.
Mens den grove dissektion beskrevet her fokuserer på gnavere, kan trabecula-isolering udføres fra ethvert intakt hjerte og har tidligere været brugt med en human hjertetrabecula8. På samme måde kan dataindsamling og analyse også anvendes på kardiomyocytter eller andre isolerede muskeltyper 1,10. Diskussionen indeholder kommentarer til mulige ændringer og tilpasninger af metoden sammen med begrænsninger, såsom forsigtighed mod at bruge papillære muskler på grund af chordae‘s mekaniske egenskaber 9.
Mekanisk kontrol af afslapning (MCR) kvantificerer afhængigheden af myokardieafslapningshastigheden af muskelforløbets belastningshastighed 8,9. Belastningshastighed, snarere end efterbelastning, er både nødvendig og tilstrækkelig til at ændre afslapningshastigheden8. Da interventioner til ændring af calciumhastigheden ikke har vist sig at forbedre hjerteafslapning væsentligt, kan mekanisk indgreb give ny indsigt i mekanismen og give en ny behandling for diastolisk dysfunktion.
Protokollen til ændring af myokardiebelastningshastigheden beskrevet her anvender en isotonisk belastningsklemme 8,9. En styrke af den isotoniske belastningsklemme er den kvantitative kontrol af efterbelastningsspændingen. Windkessel-lignende protokoller kunne bruges til yderligere at undersøge ændringer i efterbelastning, forbelastning og hjertearbejde 2,6,7. En rampe, der ikke styres af belastningsklemmen, kan også bruges til bedre at isolere ændringen i belastning fra belastningshastigheden. Uanset hvad ser efterbelastningen i sig selv ikke ud til at være en stærk modifikator af afslapningshastigheden8.
Protokollen kan også tilpasses til at nærme sig mere fysiologiske betingelser for temperatur og tempohastighed. De aktuelle protokoloplysninger blev brugt til at vise tilstedeværelsen af MCR. Gennemførelse af eksperimenter under fysiologiske forhold anbefales generelt afhængigt af det eksperimentelle spørgsmål. Imidlertid kan eksperimenter udført ved 37 ° C eller ved høje pacinghastigheder hurtigere fremkalde nedslidning (skade) på musklen. En løsning med forbedret iltbæreevne kan være nødvendig. Desuden skal dataindsamlingen være i stand til at prøve længden og kraften hurtigt nok til at løse de hurtige trækninger og give feedbackkontrol.
Den nuværende protokol beskriver ikke måling af calcium eller måling og kontrol af sarkomerlængder. Calciummålinger er blevet behandlet i andre protokoller11, mens sarkomerlængdemåling kan tilføjes med passende udstyr. Sarkomerlængdekontrol anvendes ikke i nuværende MCR-undersøgelser, fordi muskellængde er den mest korrelative parameter til den kliniske tilstand19. Yderligere sarkomerlængdekontrol (vs. muskellængdekontrol) ville give specifikke svar på kinetiske spørgsmål, men vil sandsynligvis ikke føje til translationel viden på grund af inter-sarkomervariation og den minimale forståelse af sarkomerlængdeændringer in vivo.
Tre eksperimentelle overvejelser fremhæves her for at øge reproducerbarheden af dataene.
For det første kan fritstående hjertetrabeculae være vanskelige at finde hos nogle dyr (upublicerede resultater og meddelelser). Mens trækninger muskler kan findes hos de fleste rotter, er en rimelig succesrate for at indhente data fra trabecula hos rotter en ud af tre. Trabecula succes kan være højere med Brown Norway x Lewis F1 rotter, som også er blevet brugt historisk20 og rapporteret at have flere trabeculae (upubliceret kommunikation). For mus er succesraten sandsynligvis lavere, med mindre end en ud af 10 forventes for mus fra en BL / 6-baggrund; Der forventes dog en højere frekvens for mus med FVBN-baggrund (ikke-offentliggjorte meddelelser og observationer).
For det andet kan skader på muskler reducere produktionen. Hvis de udviklede kræfter er mindre end 10 mN mm-2 ved 25 °C og 0,5 Hz pacing, kan det være nødvendigt at udføre fejlfinding for at vurdere, om der forekommer utilsigtet strækning eller kontakt mellem metaltang og muskler, hvis opløsningerne ikke er korrekt forberedt, eller hvis pacing eller eksperimentelt udstyr fungerer korrekt. Andre protokoller, der anvender intakt trabecula, har foreslået at bruge Luer-lock-sprøjter som overførselsbeholdere11. Selvom dette er muligt, især hvis brugeren styrer en meget langsom strømningshastighed eller mindre muskelsegment, bruger den nuværende protokol en meget større boreoverførselspipette for at minimere mulig skade. Et andet trin, hvor iskæmisk skade kan forekomme, er under dissektion. Aorta skal kanyleres og skylles med perfusionsopløsning inden for 3 minutter efter den første abdominale snit (rotte) eller cervikal dislokation (mus), svarende til grænserne anført i kardiomyocytisolationsprotokoller21,22. Dette minimerer den tid, hvor hjertevævet ikke udsættes for den kardioplegi-lignende perfusionsopløsning. Desuden producerer dissektioner, der varer mere end 30 minutter, generelt ikke træktrabecula. Således bør operatører øve hurtig, men omhyggelig dissektion for at minimere skader. Et tværsnitsareal over 0,2 mm 2 (2 x 10-7 m2) kan lide af kerneiskæmi20.
For det tredje bør den måde, hvorpå musklerne er fastgjort til motor- og krafttransduceren, overvejes. Denne protokol fokuserer i øjeblikket på kroge og fritstående trabeculae. Den undertiden hurtige belastningshastighed af strækningen før afslapning kan få en muskel til at glide, hvis den ikke fastgøres korrekt, hvorfor den nuværende protokol ikke bruger “kurve” til at holde trabecula23,24. Alternative monteringsmetoder (klæbemidler, clips osv.25,26) kan også overvejes og valideres. Protokollen beskrevet her bruger trabeculae og ikke papillære muskler. Papillærmuskulaturens chordae inducerer en serieelasticitet, der kan hæmme ændringer i MCR9. Imidlertid er det usandsynligt, at den nøjagtige placering af vedhæftningerne i musklen påvirker foranstaltningerne, fordi trabeculalængden (og diameteren) varierer betydeligt.
En begrænsning ved at gennembore muskelenderne med kroge er, at selve monteringspunktet også kan blive beskadiget. Mulig rivning af det anbragte muskelvæv med hyppige sammentrækninger (afhængigt af deres styrke) kan ændre længden eller seriens elasticitet. Denne rivehastighed er vanskelig at kontrollere. På samme måde kan skader på vævet og krogen forværres under strækning, hvilket også potentielt kan forårsage problemer. Visuel inspektion og de udviklede kraftværdier, der forbliver >80% af den ekvilibrerede isometriske kraft, bør anvendes til at vurdere, om præparatet er beskadiget og bør udelukkes.
En anden begrænsning eller overvejelse påvirker, hvilke eksperimentelle spørgsmål der kan besvares ved metoden. Overvej for eksempel brugen af 2,3-butandionmonoxim (BDM) i perfusionsopløsningen. BDM er en fosfatase, som kan ændre muskelfunktionen. Derudover betyder den lange periode med losning og manglende tempo, at den latente fosforyleringstilstand sandsynligvis har ændret sig. Der bør derfor udvises forsigtighed, hvis man forsøger direkte at vurdere et dyrs muskelkontraktilitet (vs. forskelle mellem genotyper eller behandlinger), da den kontraktile tilstand sandsynligvis har ændret sig. Virkningen af phosphorylering kan dog vurderes farmakologisk ved tilsætning af en agonist eller antagonist i vejen.
Sammenfattende giver MCR indsigt i, hvordan afslapning reguleres af muskelbevægelse (belastningshastighed). MCR kan bidrage til at give bedre indsigt i diagnosticering og overvågning af diastolisk sygdom sammen med mål for farmakologisk intervention, såsom ændring af myosinkinetik. Den protokol og rådgivning, der er skitseret her, beskriver viden udviklet gennem flere års forsøg og bør kunne anvendes på andre systemer og modeller for hjertesygdomme.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde støttes af National Institutes of Health (1R01HL151738) og American Heart Association (18TPA34170169).
18 or 16 gauge blunted needle/canula | for cannulation of rat aorta, use 1mm of PE160 or PE205 tubing as stop | ||
2,3-Butanedione Monoxime | Sigma-Aldrich | B0753-25G | |
23 gauge blunted needle/canula | for cannulation of mouse aorta, use 1mm of PE50 tubing as stop | ||
5 mL syringe | BD Luer-Lock | 309646 | |
95% Oxygen/5% CO2 | AirGas | Z02OX9522000043 | |
Anethesia system | EZ Systems | EZ-SA800 | Can use any appropriate anethesia method/system |
Bovine Serum Albumin | Fisher BioReagents | BP-1600 | to coat tips of fine forcepts, scissors |
Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Chemical | C79-500 | |
Containers/dissection dishes | FisherBrand | 08-732-113 | Weigh dishes for creating dissection plates |
Crile Hemostat | Fine Science Tools | 13005-14 | for mouse gross dissection |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
Data acquisition software | SLControl | ||
Data acquisition system | MicrostarLabs | DAP5216a | Can use any DAQ. This is a PCI based data acqusition for use with SLControl; must have a PC with a PCI slot |
Data analysis software | Mathworks | Matlab | Custom Script |
Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | 2x for cannulation of aorta |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | 2x for trabecula isolation |
Experimental system | Aurora Scientific | 801C | Can use any appropriate experimental chamber with force and length control |
Fine Scissors, curved | Fine Science Tools | 14061-09 | for removal of heart |
Gooseneck Piggyback Illuminator | AmScope | LED-6WA | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
Imaging software | IrfanView | ||
Iris Forceps | World Precision Instruments | 15915 | for removal of heart |
Isoflurane | VetOne | 502017 | |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670-100G | |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
Mayo Scissors | Fine Science Tools | 14110-15 | for rat gross dissection |
Metzenbaum Scissors | Fine Science Tools | 14116-14 | for mouse gross dissection |
Microscope connected camera | Flir | BFS-U3-27S5M-C | Includes acquisition software |
Microscope/digital imaging system | Olympus | IX-73 | Can use any appropriate microscope. Needed to measure muscle length, cross sectional area |
Mounting Pin/Needle | BD PrecisionGlide | 305136 | For holding heart to dish. 27 G x 1-1/4 |
Mounting Pin/Needle | Fine Science Tools | 26000-40 | For holding heart to dish. 0.4mm diameter insect pin (Alt to 27G needle) |
Oxygen (O2) | AirGas | OX USP300 | |
Peristaltic Pump | Rainin | Rabbit | Can be any means to create flow in experimental chamber |
pH and Oxygen sensor | Mettler Toledo | SevenGo pH and DO | |
Potassium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 237205-100G | |
Potassium Chloride | Fisher Chemical | P217-500 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 795488-500G | |
Rochester-pean Hemostat | World Precision Instruments | 501708 | for rat gross dissection |
Silk Suture, Size: 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | cut to ~1.5 inch pieces, soaked in water |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-1KG | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | S7907-100G | |
Stereomicroscope | AmScope | SM-1TX | |
Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | for opening of the RV |
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 3097358-1004 | For creating dissection plates |
Syringe Holder | Harbor Frieght | Helping Hands 60501 | Can be used as alternate for ring stand |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625-1KG | |
Transfer Pipette | FisherBrand | 13-711-7M | cut ~1" from tip to widen bore |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | for trabecula isolation |