सामान्य शरीर विज्ञान के लिए तेजी से मायोकार्डियल और कार्डियक विश्राम आवश्यक है। यांत्रिक विश्राम तंत्र अब तनाव दर पर निर्भर होने के लिए जाना जाता है। यह प्रोटोकॉल विश्राम के यांत्रिक नियंत्रण का आगे अध्ययन करने के लिए प्रयोगों के अधिग्रहण और विश्लेषण का अवलोकन प्रदान करता है।
डायस्टोलिक डिसफंक्शन कार्डियोवैस्कुलर रोग प्रस्तुतियों में एक सामान्य फेनोटाइप है। ऊंचा हृदय कठोरता (ऊंचा बाएं वेंट्रिकुलर एंड-डायस्टोलिक दबाव) के अलावा, बिगड़ा हुआ हृदय विश्राम डायस्टोलिक शिथिलता का एक प्रमुख नैदानिक संकेतक है। जबकि विश्राम के लिए साइटोसोलिक कैल्शियम को हटाने और सार्कोमेरिक पतले फिलामेंट्स को निष्क्रिय करने की आवश्यकता होती है, ऐसे तंत्र को लक्षित करना अभी तक प्रभावी उपचार प्रदान नहीं कर पाया है। यांत्रिक तंत्र, जैसे रक्तचाप (यानी, आफ्टरलोड), विश्राम को संशोधित करने के लिए सिद्धांतित किया गया है। हाल ही में, हमने दिखाया कि खिंचाव की तनाव दर को संशोधित करना, न कि आफ्टरलोड, मायोकार्डियल ऊतक की बाद की विश्राम दर को संशोधित करने के लिए आवश्यक और पर्याप्त दोनों था। विश्राम की तनाव दर निर्भरता, जिसे मैकेनिकल कंट्रोल ऑफ रिलैक्सेशन (एमसीआर) कहा जाता है, का आकलन बरकरार कार्डियक ट्रेबेक्यूका का उपयोग करके किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल एक छोटे पशु मॉडल, प्रयोगात्मक प्रणाली और कक्ष की तैयारी, हृदय के अलगाव और बाद में एक ट्रेबेकुला के अलगाव, प्रयोगात्मक कक्ष की तैयारी, और प्रयोगात्मक और विश्लेषण प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। बरकरार दिल में उपभेदों को लंबा करने के सबूत बताते हैं कि एमसीआर औषधीय उपचार के बेहतर लक्षण वर्णन के लिए नए क्षेत्र प्रदान कर सकता है, साथ ही बरकरार मांसपेशियों में मायोफिलामेंट कैनेटीक्स का आकलन करने की एक विधि के साथ। इसलिए, एमसीआर का अध्ययन दिल की विफलता के उपचार में नए दृष्टिकोण और नए मोर्चों के लिए एक रास्ता स्पष्ट कर सकता है।
हृदय की विफलता के लगभग सभी रूपों में कार्डियक विश्राम बिगड़ा हुआ है (कम इजेक्शन अंश के साथ दिल की विफलता सहित) और कई कार्डियोवैस्कुलर बीमारियों में। परमेबिलाइज्ड मांसपेशियों में कार्डियक फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के कई तरीकों के अलावा, बरकरार हृदय की मांसपेशियों का मूल्यांकन रुचि प्राप्त कर रहा है। ऐसे ऊतकों का मूल्यांकन अनलोडेड (अनुबंध के लिए मुक्त छोर) या लोड (लंबाई या बल नियंत्रित) किया जाता है। ऐतिहासिक रूप से, बरकरार पृथक मायोसाइट्स का मूल्यांकन एक अनलोडेड स्थिति में किया गया है, जहां कोशिका शरीर संकुचन के दौरान छोटा होने के लिए स्वतंत्र है। बरकरार कार्डियक ट्रेबेक्यूले का मूल्यांकन अक्सर आइसोमेट्रिक स्थितियों में किया जाता है, जहां लंबाई को बदलने की अनुमति नहीं होती है, लेकिन तनाव (प्रति पार-अनुभागीय क्षेत्र बल) उत्पन्न होता है। बरकरार मायोसाइट और ट्रेबेक्यूले दोनों विधियां लोड 1,2 के संशोधनों के साथ अभिसरण करना शुरू कर रही हैं।
एक मांसपेशी को लोड-क्लैंपिंग के लिए प्रोटोकॉल (यानी, एक निर्दिष्ट मूल्य पर एक मांसपेशी के विकसित तनाव को नियंत्रित करना जो फिजियोलॉजिकल आफ्टरलोड का अनुकरण करता है)कई दशकों में विकसित किए गए हैं। बरकरार हृदय ऊतकों में, लोड-क्लैंप शोधकर्ताओं को आइसोटोनिक या विंडकेसल जैसे आफ्टरलोड 6,7,8,9 का उपयोग करके विवो कार्डियक चक्र में अधिक बारीकी से नकल करने की अनुमति देते हैं। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एमसीआर (यानी, छूट दर की तनाव दर निर्भरता) 8,9 को निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले डेटा प्राप्त करना है।
जबकि एमसीआर प्रोटोकॉल को पूर्व कार्य से अनुकूलित किया गया है, इस प्रोटोकॉल का ध्यान (बरकरार हृदय ऊतकों का उपयोग करने वाले समान प्रोटोकॉल की तुलना में) बायोमेकेनिकल तंत्र पर है जो विश्राम को संशोधित करता है। लोड-क्लैंपिंग 3,4,5,7,10 का उपयोग करने वाले कई प्रोटोकॉल हैं और विंडकेसेल मॉडल 1,2,11 पर ध्यान केंद्रित करने वाले प्रोटोकॉल हैं, लेकिन यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से वर्णन करता है कि विश्राम से पहले खिंचाव विश्राम दर को कैसे संशोधित करता है। हमने दिखाया है कि यह नियंत्रण प्रोटो-डायस्टोलिक अवधि8 के दौरान होता है, एक चरण जो मूल रूप से विगर्स12 द्वारा वर्णित है। सामान्य स्वस्थ दिलों में, मायोकार्डियम महाधमनी वाल्व बंद होने से पहले इजेक्शन के दौरान एक लंबा तनाव से गुजरता है (यानी, आइसोवोलुमिक विश्राम से पहले)13। यह आफ्टरलोड नियंत्रण की अवधि को लम्बा करके नकल की जाती है जब तक कि मांसपेशियों में खिंचाव शुरू न हो जाए। नैदानिक साक्ष्य बताते हैं कि यह लंबा पन रोगराज्यों 14 में क्षीण या खो सकता है, और परिवर्तित अंत-सिस्टोलिक तनाव दरों के निहितार्थ और तंत्र पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किए गए हैं। एक संरक्षित इजेक्शन अंश के साथ डायस्टोलिक रोगों और दिल की विफलता के लिए विरल उपचार विकल्पों को देखते हुए, हम मानते हैं कि एमसीआर बिगड़ा हुआ विश्राम अंतर्निहित नए तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है।
जबकि यहां वर्णित सकल विच्छेदन कृन्तकों पर केंद्रित है, ट्रेबेकुला अलगाव किसी भी बरकरार दिल से किया जा सकता है, और पहले मानव कार्डियक ट्रेबेकुला8 के साथ इस्तेमाल किया गया है। इसी तरह, डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण कार्डियोमायोसाइट्स या अन्य पृथक मांसपेशी प्रकार 1,10 पर भी लागू किया जा सकता है। चर्चा में सीमाओं के साथ-साथ विधि में संभावित परिवर्तन और अनुकूलन पर टिप्पणी शामिल है, जैसे कि कॉर्डे9 के यांत्रिक गुणों के कारण पैपिलरी मांसपेशियों का उपयोग करने के खिलाफ सावधानी।
विश्राम का यांत्रिक नियंत्रण (एमसीआर) मांसपेशियों की कार्यवाही छूट 8,9 की तनाव दर पर मायोकार्डियल छूट दर की निर्भरता को निर्धारित करता है। आफ्टरलोड के बजाय तनाव दर, छूट दर8 को संशोधित करने के लिए आवश्यक और पर्याप्त दोनों है। चूंकि कैल्शियम दर को संशोधित करने के लिए हस्तक्षेप कार्डियक विश्राम में काफी सुधार करने के लिए साबित नहीं हुए हैं, यांत्रिक हस्तक्षेप तंत्र में नई अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है और डायस्टोलिक डिसफंक्शन के लिए एक नया उपचार प्रदान कर सकता है।
यहां वर्णित मायोकार्डियल तनाव दर को संशोधित करने के लिए प्रोटोकॉल एक आइसोटोनिक लोड-क्लैंप 8,9 का उपयोग करता है। आइसोटोनिक लोड-क्लैंप की एक ताकत आफ्टरलोड तनाव का मात्रात्मक नियंत्रण है। विंडकेसेल जैसे प्रोटोकॉल का उपयोग आफ्टरलोड, प्रीलोड और कार्डियक वर्क 2,6,7 में बदलाव की जांच के लिए किया जा सकता है। लोड-क्लैंप द्वारा नियंत्रित नहीं किए गए एक रैंप का उपयोग तनाव दर से तनाव में बदलाव को बेहतर ढंग से अलग करने के लिए भी किया जा सकता है। भले ही, आफ्टरलोड स्वयं छूट दर8 का एक मजबूत संशोधक प्रतीत नहीं होता है।
प्रोटोकॉल को तापमान और पेसिंग दर के लिए अधिक शारीरिक स्थितियों तक पहुंचने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। एमसीआर की उपस्थिति दिखाने के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल विवरण का उपयोग किया गया था। प्रयोगात्मक प्रश्न के आधार पर शारीरिक स्थितियों में प्रयोगों का संचालन आम तौर पर अनुशंसित है। हालांकि, 37 डिग्री सेल्सियस या उच्च पेसिंग दर पर किए गए प्रयोग, मांसपेशियों को रनडाउन (क्षति) को अधिक तेजी से प्रेरित कर सकते हैं। बेहतर ऑक्सीजन वहन क्षमता वाले समाधान की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, डेटा अधिग्रहण तेजी से स्विच को हल करने और प्रतिक्रिया नियंत्रण प्रदान करने के लिए लंबाई और बल का तेजी से नमूना लेने में सक्षम होना चाहिए।
वर्तमान प्रोटोकॉल कैल्शियम के माप या सरकोमेरे लंबाई के माप और नियंत्रण का वर्णन नहीं करता है। कैल्शियम माप को अन्य प्रोटोकॉल11 में संबोधित किया गया है, जबकि सार्कोमेरे लंबाई माप को उचित उपकरणों के साथ जोड़ा जा सकता है। वर्तमान एमसीआर अध्ययनों में सरकोमेरे लंबाई नियंत्रण का उपयोग नहीं किया जाता है, क्योंकि मांसपेशियों की लंबाई नैदानिक स्थिति19 के लिए सबसे अधिक सापेक्ष पैरामीटर है। इसके अलावा सरकोमेरे लंबाई नियंत्रण (बनाम मांसपेशियों की लंबाई नियंत्रण) गतिज प्रश्नों के विशिष्ट उत्तर प्रदान करेगा, लेकिन अंतर-सार्कोमेरे भिन्नता और विवो में सरकोमेरे लंबाई परिवर्तनों की न्यूनतम समझ के कारण ट्रांसलेशनल ज्ञान को जोड़ने की संभावना नहीं है।
डेटा की प्रजनन क्षमता बढ़ाने के लिए यहां तीन प्रयोगात्मक विचारों पर प्रकाश डाला गया है।
सबसे पहले, कुछ जानवरों (अप्रकाशित परिणाम और संचार) में फ्री-स्टैंडिंग कार्डियक ट्रेबेक्यूले को ढूंढना मुश्किल हो सकता है। जबकि अधिकांश चूहों में चिकोटी की मांसपेशियां पाई जा सकती हैं, चूहों में ट्रेबेकुला से डेटा प्राप्त करने के लिए एक उचित सफलता दर तीन में से एक है। ब्राउन नॉर्वे एक्स लुईस एफ 1 चूहों के साथ ट्रैबेकुला की सफलता अधिक हो सकती है, जिनका उपयोग ऐतिहासिक रूप से20 बार भी किया गया है और अधिक ट्रैबेक्यूले (अप्रकाशित संचार) होने की सूचना मिली है। चूहों के लिए, सफलता दर कम होने की संभावना है, बीएल / 6 पृष्ठभूमि से चूहों के लिए 10 में से एक से कम की उम्मीद है; हालांकि, एफवीबीएन पृष्ठभूमि (अप्रकाशित संचार और अवलोकन) से चूहों के लिए एक उच्च दर की उम्मीद है।
दूसरा, मांसपेशियों को नुकसान आउटपुट को कम कर सकता है। यदि विकसित बल 25 डिग्री सेल्सियस और 0.5 हर्ट्ज पेसिंग पर 10 mN mm-2 से कम हैं, तो जांचकर्ताओं को यह आकलन करने के लिए समस्या निवारण करने की आवश्यकता हो सकती है कि क्या धातु बल और मांसपेशियों के बीच अनजाने में खिंचाव या संपर्क हो रहा है, यदि समाधान ठीक से तैयार नहीं किए गए हैं, या यदि पेसिंग या प्रयोगात्मक उपकरण ठीक से काम कर रहे हैं। बरकरार ट्रेबेकुला का उपयोग करने वाले अन्य प्रोटोकॉल ने स्थानांतरण जहाजों11 के रूप में लुएर-लॉक सिरिंज का उपयोग करने का सुझाव दिया है। हालांकि यह संभव है, खासकर यदि उपयोगकर्ता बहुत धीमी प्रवाह दर या छोटे मांसपेशी खंड को नियंत्रित करता है, तो वर्तमान प्रोटोकॉल संभावित क्षति को कम करने के लिए बहुत बड़े बोर ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करता है। एक और कदम जहां इस्केमिक क्षति हो सकती है वह विच्छेदन के दौरान है। कार्डियोमायोसाइट्स आइसोलेशन प्रोटोकॉल21,22 में सूचीबद्ध सीमाओं के समान, महाधमनी को पहले पेट के कट (चूहे) या ग्रीवा अव्यवस्था (माउस) के 3 मिनट के भीतर छिड़काव समाधान के साथ प्रवेशित और फ्लश किया जाना चाहिए। यह उस समय को कम करता है जब हृदय के ऊतक कार्डियोप्लेजिया जैसे छिड़काव समाधान के संपर्क में नहीं आते हैं। इसके अलावा, 30 मिनट से अधिक समय तक चलने वाले विच्छेदन आम तौर पर ट्विचिंग ट्रेबेकुला का उत्पादन नहीं करते हैं। इस प्रकार, ऑपरेटरों को क्षति को कम करने के लिए तेजी से लेकिन सावधानीपूर्वक विच्छेदन का अभ्यास करना चाहिए। 0.2 मिमी 2 (2 x 10-7 मीटर2) से ऊपर एक क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र कोर इस्किमिया20 से पीड़ित हो सकता है।
तीसरा, जिस तरह से मांसपेशियों को मोटर और बल ट्रांसड्यूसर से जोड़ा जाता है, उस पर विचार किया जाना चाहिए। यह प्रोटोकॉल वर्तमान में हुक और फ्री-स्टैंडिंग ट्रेबेक्यूले पर केंद्रित है। विश्राम से पहले खिंचाव की कभी-कभी तीव्र तनाव दर एक मांसपेशी को स्लाइड करने का कारण बन सकती है यदि ठीक से चिपकाया नहीं जाता है, यही कारण है कि वर्तमान प्रोटोकॉल ट्रैबेकुला23,24 को पकड़ने के लिए “टोकरी” का उपयोग नहीं करता है। वैकल्पिक माउंटिंग विधियों (चिपकने वाला, क्लिप, आदि25,26) पर भी विचार किया जा सकता है और मान्य किया जा सकता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल ट्रेबेक्यूले का उपयोग करता है और पैपिलरी मांसपेशियों का नहीं। पैपिलरी मांसपेशी का कॉर्डे एक श्रृंखला लोच को प्रेरित करता है जो एमसीआर9 में परिवर्तन को रोक सकता है। हालांकि, मांसपेशियों में संलग्नक का सटीक प्लेसमेंट उपायों को प्रभावित करने की संभावना नहीं है, क्योंकि ट्रेबेकुला लंबाई (और व्यास) काफी भिन्न होती है।
हुक के साथ मांसपेशियों के सिरों को छेदने की एक सीमा यह है कि माउंटिंग पॉइंट भी क्षतिग्रस्त हो सकता है। लगातार संकुचन (उनकी ताकत के आधार पर) के साथ चिपके हुए मांसपेशी ऊतक का संभावित फटना लंबाई या श्रृंखला लोच को बदल सकता है। फाड़ने की इस दर को नियंत्रित करना मुश्किल है। इसी तरह, खिंचाव के दौरान ऊतक और हुक को नुकसान बढ़ सकता है, संभावित रूप से समस्याएं भी पैदा कर सकता है। दृश्य निरीक्षण, और समतुल्य आइसोमेट्रिक बल के शेष >80% विकसित बल मूल्यों का उपयोग यह आकलन करने के लिए किया जाना चाहिए कि क्या तैयारी क्षतिग्रस्त है और इसे बाहर रखा जाना चाहिए।
एक और सीमा या विचार प्रभावित करता है कि विधि द्वारा किन प्रयोगात्मक प्रश्नों का उत्तर दिया जा सकता है। उदाहरण के लिए, छिड़काव समाधान में 2,3-ब्यूटेनडियोन मोनोक्सीम (बीडीएम) के उपयोग पर विचार करें। बीडीएम एक फॉस्फेट है, जो मांसपेशियों के कार्य को बदल सकता है। इसके अलावा, अनलोडिंग की लंबी अवधि और पेसिंग की कमी का मतलब है कि अव्यक्त फॉस्फोराइलेशन स्थिति संभवतः बदल गई है। इस प्रकार, सावधानी का उपयोग किया जाना चाहिए यदि किसी जानवर की मांसपेशियों की सिकुड़न (बनाम जीनोटाइप या उपचार के बीच अंतर) का सीधे आकलन करने की कोशिश की जाती है, क्योंकि सिकुड़ा हुआ राज्य संभवतः बदल गया है। हालांकि, फॉस्फोराइलेशन के प्रभाव का मूल्यांकन मार्ग के एगोनिस्ट या विरोधी को जोड़कर औषधीय रूप से किया जा सकता है।
सारांश में, एमसीआर इस बात की जानकारी प्रदान करता है कि मांसपेशियों की गति (तनाव दर) द्वारा विश्राम को कैसे नियंत्रित किया जाता है। एमसीआर डायस्टोलिक रोग के निदान और निगरानी में बेहतर अंतर्दृष्टि प्रदान करने में मदद कर सकता है, साथ ही औषधीय हस्तक्षेप के लिए लक्ष्य, जैसे कि मायोसिन कैनेटीक्स को संशोधित करना। यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल और सलाह कई वर्षों के परीक्षणों में विकसित ज्ञान को बताती है, और हृदय रोग के अन्य प्रणालियों और मॉडलों पर लागू होनी चाहिए।
The authors have nothing to disclose.
यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (1R01HL151738) और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (18TPA34170169) द्वारा समर्थित है।
18 or 16 gauge blunted needle/canula | for cannulation of rat aorta, use 1mm of PE160 or PE205 tubing as stop | ||
2,3-Butanedione Monoxime | Sigma-Aldrich | B0753-25G | |
23 gauge blunted needle/canula | for cannulation of mouse aorta, use 1mm of PE50 tubing as stop | ||
5 mL syringe | BD Luer-Lock | 309646 | |
95% Oxygen/5% CO2 | AirGas | Z02OX9522000043 | |
Anethesia system | EZ Systems | EZ-SA800 | Can use any appropriate anethesia method/system |
Bovine Serum Albumin | Fisher BioReagents | BP-1600 | to coat tips of fine forcepts, scissors |
Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Chemical | C79-500 | |
Containers/dissection dishes | FisherBrand | 08-732-113 | Weigh dishes for creating dissection plates |
Crile Hemostat | Fine Science Tools | 13005-14 | for mouse gross dissection |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
Data acquisition software | SLControl | ||
Data acquisition system | MicrostarLabs | DAP5216a | Can use any DAQ. This is a PCI based data acqusition for use with SLControl; must have a PC with a PCI slot |
Data analysis software | Mathworks | Matlab | Custom Script |
Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | 2x for cannulation of aorta |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | 2x for trabecula isolation |
Experimental system | Aurora Scientific | 801C | Can use any appropriate experimental chamber with force and length control |
Fine Scissors, curved | Fine Science Tools | 14061-09 | for removal of heart |
Gooseneck Piggyback Illuminator | AmScope | LED-6WA | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
Imaging software | IrfanView | ||
Iris Forceps | World Precision Instruments | 15915 | for removal of heart |
Isoflurane | VetOne | 502017 | |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670-100G | |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
Mayo Scissors | Fine Science Tools | 14110-15 | for rat gross dissection |
Metzenbaum Scissors | Fine Science Tools | 14116-14 | for mouse gross dissection |
Microscope connected camera | Flir | BFS-U3-27S5M-C | Includes acquisition software |
Microscope/digital imaging system | Olympus | IX-73 | Can use any appropriate microscope. Needed to measure muscle length, cross sectional area |
Mounting Pin/Needle | BD PrecisionGlide | 305136 | For holding heart to dish. 27 G x 1-1/4 |
Mounting Pin/Needle | Fine Science Tools | 26000-40 | For holding heart to dish. 0.4mm diameter insect pin (Alt to 27G needle) |
Oxygen (O2) | AirGas | OX USP300 | |
Peristaltic Pump | Rainin | Rabbit | Can be any means to create flow in experimental chamber |
pH and Oxygen sensor | Mettler Toledo | SevenGo pH and DO | |
Potassium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 237205-100G | |
Potassium Chloride | Fisher Chemical | P217-500 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 795488-500G | |
Rochester-pean Hemostat | World Precision Instruments | 501708 | for rat gross dissection |
Silk Suture, Size: 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | cut to ~1.5 inch pieces, soaked in water |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-1KG | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | S7907-100G | |
Stereomicroscope | AmScope | SM-1TX | |
Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | for opening of the RV |
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 3097358-1004 | For creating dissection plates |
Syringe Holder | Harbor Frieght | Helping Hands 60501 | Can be used as alternate for ring stand |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625-1KG | |
Transfer Pipette | FisherBrand | 13-711-7M | cut ~1" from tip to widen bore |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | for trabecula isolation |