Rask myokard- og hjerteavslapping er viktig for normal fysiologi. Mekaniske avslapningsmekanismer er nå kjent for å være avhengig av belastningshastighet. Denne protokollen gir en oversikt over oppkjøp og analyse av eksperimenter for å studere den mekaniske kontrollen av avslapning ytterligere.
Diastolisk dysfunksjon er en vanlig fenotype på tvers av kardiovaskulære sykdomspresentasjoner. I tillegg til forhøyet hjertestivhet (forhøyet venstre ventrikkel endediastolisk trykk) er nedsatt hjerterelaksasjon en viktig diagnostisk indikator på diastolisk dysfunksjon. Mens avslapning krever fjerning av cytosolisk kalsium og deaktivering av sarkomeriske tynne filamenter, har målretting av slike mekanismer ennå ikke gitt effektive behandlinger. Mekaniske mekanismer, som blodtrykk (dvs. etterbelastning), har blitt teoretisert for å modifisere avslapning. Nylig viste vi at modifisering av belastningshastigheten til en strekning, ikke etterbelastning, var både nødvendig og tilstrekkelig til å modifisere den påfølgende avslapningshastigheten av myokardvev. Belastningshastighetsavhengigheten av avslapning, kalt mekanisk kontroll av avslapning (MCR), kan vurderes ved hjelp av intakte hjertetrabekler. Denne protokollen beskriver utarbeidelse av en smådyrmodell, eksperimentelt system og kammer, isolering av hjertet og påfølgende isolering av en trabecula, forberedelse av eksperimentkammeret og eksperimentelle og analyseprotokoller. Bevis for forlengelse av stammer i det intakte hjertet tyder på at MCR kan gi nye arenaer for bedre karakterisering av farmakologiske behandlinger, sammen med en metode for å vurdere myofilamentkinetikk i intakte muskler. Derfor kan studier av MCR belyse en vei til nye tilnærminger og nye grenser i behandlingen av hjertesvikt.
Hjerterelaksasjon er svekket ved nesten alle former for hjertesvikt (inkludert hjertesvikt med redusert ejeksjonsfraksjon) og ved mange hjerte- og karsykdommer. I tillegg til mange metoder for å evaluere hjertefunksjonen i permeabiliserte muskler, får evalueringen av intakte hjertemuskler interesse. Slike vev vurderes losset (ender fri til kontrakt) eller lastet (lengde eller kraftstyrt). Historisk har intakte isolerte myocytter blitt evaluert i en ubelastet tilstand, hvor cellelegemet er fritt til å forkortes under sammentrekning. Intakte hjertetrabekler evalueres ofte under isometriske forhold, der lengden ikke får endre seg, men stress (kraft per tverrsnittsareal) genereres. Både intakte myocytt- og trabeculae-metoder begynner å konvergere med modifikasjoner av belastning 1,2.
Protokoller for belastningsklemming av en muskel (dvs. kontroll av en muskels utviklede stress ved en spesifisert verdi som simulerer fysiologiske etterbelastninger) har blitt utviklet over flere tiår 3,4,5. I intakte hjertevev tillater belastningsklemmer forskere å etterligne in vivo hjertesyklusen ved hjelp av isotoniske eller Windkessel-lignende etterbelastninger 6,7,8,9. Målet med denne protokollen er å skaffe data som brukes til å kvantifisere MCR (dvs. belastningshastighetsavhengigheten av avslapningshastigheten)8,9.
Mens MCR-protokollen er tilpasset fra tidligere arbeid, er fokuset på denne protokollen (sammenlignet med lignende protokoller som bruker intakt hjertevev) på biomekaniske mekanismer som modifiserer avslapning. Det er flere protokoller som bruker lastklemming 3,4,5,7,10 og protokoller som fokuserer på Windkessel-modeller 1,2,11, men denne protokollen beskriver spesifikt hvordan strekk før avslapning endrer avslapningshastigheten. Vi har vist at denne kontrollen skjer i en proto-diastolisk periode8, en fase opprinnelig beskrevet av Wiggers12. I normalt friske hjerter gjennomgår myokardiet en forlengende belastning under utstøting før aortaklafflukking (dvs. før isovolumisk relaksasjon)13. Dette etterlignes ved å forlenge varigheten av etterbelastningskontroll til muskelen begynner å strekke seg. Klinisk dokumentasjon tyder på at denne forlengelsen kan svekkes eller gå tapt ved sykdomstilstander14, og implikasjonene og mekanismene for endrede endesystoliske belastningshastigheter er ikke fullstendig klarlagt. Gitt de sparsomme behandlingsalternativene for diastoliske sykdommer og hjertesvikt med en bevart ejeksjonsfraksjon, antyder vi at MCR kan gi innsikt i nye mekanismer som ligger til grunn for nedsatt relaksasjon.
Mens grovdisseksjonen beskrevet her fokuserer på gnagere, kan trabecula-isolering utføres fra ethvert intakt hjerte, og har tidligere blitt brukt med en human hjertetrabecula8. På samme måte kan datainnsamlingen og analysen også brukes på kardiomyocytter eller andre isolerte muskeltyper 1,10. Diskusjonen inkluderer kommentarer til mulige endringer og tilpasninger til metoden, sammen med begrensninger, for eksempel forsiktighet mot å bruke papillære muskler på grunn av de mekaniske egenskapene til akkordae9.
Mekanisk kontroll av avslapning (MCR) kvantifiserer avhengigheten av myokardial avslapningshastighet på belastningshastigheten til muskelavslapningen 8,9. Belastningshastighet, i stedet for etterbelastning, er både nødvendig og tilstrekkelig til å endre avslapningshastigheten8. Siden intervensjoner for å modifisere kalsiumhastigheten ikke har vist seg å forbedre hjerteavslappingen vesentlig, kan mekanisk inngrep gi ny innsikt i mekanismen og gi en ny behandling for diastolisk dysfunksjon.
Protokollen for å modifisere myokardstammehastigheten beskrevet her benytter en isoton belastningsklemme 8,9. En styrke ved den isotone lastklemmen er den kvantitative kontrollen av etterbelastningsspenningen. Windkessel-lignende protokoller kan brukes til å undersøke endringer i etterbelastning, forbelastning og hjertearbeid 2,6,7. En rampe som ikke styres av lastklemmen, kan også brukes til å bedre isolere endringen i belastning fra belastningshastighet. Uansett ser ikke etterbelastningen i seg selv ut til å være en sterk modifikator av avslapningshastigheten8.
Protokollen kan også tilpasses for å nærme seg mer fysiologiske forhold for temperatur og tempohastighet. De gjeldende protokolldetaljene ble brukt til å vise tilstedeværelsen av MCR. Gjennomføring av eksperimenter under fysiologiske forhold anbefales generelt, avhengig av eksperimentelle spørsmål. Imidlertid kan eksperimenter utført ved 37 °C, eller ved høye tempohastigheter, raskere indusere nedkjøring (skade) på muskelen. Det kan være behov for en løsning med forbedret oksygenbæreevne. Videre må datainnsamlingen kunne prøve lengden og kraften raskt nok til å løse de raske rykningene og gi tilbakemeldingskontroll.
Gjeldende protokoll beskriver ikke måling av kalsium eller måling og kontroll av sarkomerlengder. Kalsiummålinger er adressert i andre protokoller11, mens sarkomerlengdemåling kan legges til med passende utstyr. Sarkomerlengdekontroll benyttes ikke i nåværende MCR-studier, fordi muskellengde er den mest korrelative parameteren til den kliniske tilstanden19. Videre sarkomerlengdekontroll (vs. muskellengdekontroll) vil gi spesifikke svar på kinetiske spørsmål, men vil neppe øke translasjonskunnskapen på grunn av intersarkomervariasjon og minimumsforståelsen av sarkomerlengdeendringer in vivo.
Tre eksperimentelle hensyn er fremhevet her for å øke reproduserbarheten av dataene.
For det første kan frittstående hjertetrabekler være vanskelig å finne hos noen dyr (upubliserte resultater og kommunikasjon). Mens rykningsmuskler kan finnes hos de fleste rotter, er en rimelig suksessrate for å skaffe data fra trabecula hos rotter en av tre. Trabecula-suksessen kan være høyere med Brown Norway x Lewis F1-rotter, som også har vært brukt historisk20 og rapportert å ha flere trabeculae (upublisert kommunikasjon). For mus vil suksessratene sannsynligvis være lavere, med mindre enn en av 10 forventet for mus med BL/6-bakgrunn; Imidlertid forventes en høyere rate for mus med FVBN-bakgrunn (upublisert kommunikasjon og observasjoner).
For det andre kan skade på muskler redusere produksjonen. Hvis de utviklede kreftene er mindre enn 10 mN mm-2 ved 25 ° C og 0,5 Hz pacing, kan etterforskere trenge å utføre feilsøking for å vurdere om utilsiktet strekking eller kontakt mellom metalltang og muskel oppstår, hvis løsninger ikke er riktig forberedt, eller hvis pacing eller eksperimentelt utstyr fungerer som det skal. Andre protokoller som benytter intakt trabecula har foreslått å bruke Luer-lock sprøyter som overføringsfartøy11. Selv om dette er mulig, spesielt hvis brukeren kontrollerer en svært langsom strømningshastighet eller mindre muskelsegment, bruker den nåværende protokollen en mye større boreoverføringspipette for å minimere mulig skade. Et annet trinn hvor iskemisk skade kan oppstå er under disseksjon. Aorta bør kanyleres og skylles med perfusjonsoppløsning innen 3 minutter etter første abdominale kutt (rotte) eller cervikal dislokasjon (mus), tilsvarende grensene listet opp i kardiomyocyttisolasjonsprotokollene21,22. Dette minimerer tiden når hjertevevet ikke blir utsatt for den kardioplegi-lignende perfusjonsløsningen. Videre produserer disseksjoner som varer mer enn 30 minutter vanligvis ikke rykninger trabecula. Dermed bør operatørene øve rask, men forsiktig disseksjon for å minimere skade. Et tverrsnittsareal over 0, 2 mm 2 (2 x 10-7 m2) kan lide av kjerneiskemi20.
For det tredje bør måten musklene er festet til motoren og krafttransduseren vurderes på. Denne protokollen fokuserer for tiden på kroker og frittstående trabekler. Den noen ganger raske belastningshastigheten på strekningen før avslapning kan føre til at en muskel glir hvis den ikke er festet riktig, og det er grunnen til at den nåværende protokollen ikke bruker “kurver” for å holde trabecula23,24. Alternative monteringsmetoder (lim, klips, etc25,26) kan også vurderes og valideres. Protokollen beskrevet her bruker trabeculae og ikke papillære muskler. Papillærmuskelens akkordae induserer en serieelastisitet som kan hemme endringer i MCR9. Den nøyaktige plasseringen av festene i muskelen vil imidlertid neppe påvirke tiltakene, fordi trabekulalengden (og diameteren) varierer betydelig.
En begrensning ved å stikke hull i muskelendene med kroker er at selve monteringspunktet også kan bli skadet. Mulig rive av det festede muskelvevet med hyppige sammentrekninger (avhengig av deres styrke) kan endre lengden eller serieelastisiteten. Denne rivehastigheten er vanskelig å kontrollere. På samme måte kan skader på vevet og kroken forverres under strekking, noe som også potensielt kan forårsake problemer. Visuell inspeksjon, og de utviklede kraftverdiene som gjenstår >80 % av den likevektige isometriske kraften, bør brukes til å vurdere om preparatet er skadet og bør utelukkes.
En annen begrensning eller vurdering påvirker hvilke eksperimentelle spørsmål som kan besvares av metoden. For eksempel, vurder bruk av 2,3-butandionmonoksim (BDM) i perfusjonsløsningen. BDM er en fosfatase, som kan endre funksjonen av muskelen. I tillegg betyr den lange perioden med lossing og mangel på pacing at den latente fosforyleringstilstanden sannsynligvis har endret seg. Derfor bør forsiktighet utvises hvis man prøver å direkte vurdere muskelkontraktiliteten til et dyr (vs. forskjeller mellom genotyper eller behandlinger), da kontraktiltilstanden sannsynligvis har endret seg. Virkningen av fosforylering kan imidlertid vurderes farmakologisk ved å legge til en agonist eller antagonist av banen.
Oppsummert gir MCR innsikt i hvordan avspenning reguleres av muskelbevegelser (belastningshastighet). MCR kan bidra til å gi bedre innsikt i diagnostisering og overvåking av diastolisk sykdom, sammen med mål for farmakologisk intervensjon, for eksempel modifisering av myosinkinetikk. Protokollen og rådene som er skissert her, beskriver kunnskap utviklet over flere års studier, og bør gjelde for andre systemer og modeller for hjertesykdom.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet støttes av National Institutes of Health (1R01HL151738) og American Heart Association (18TPA34170169).
18 or 16 gauge blunted needle/canula | for cannulation of rat aorta, use 1mm of PE160 or PE205 tubing as stop | ||
2,3-Butanedione Monoxime | Sigma-Aldrich | B0753-25G | |
23 gauge blunted needle/canula | for cannulation of mouse aorta, use 1mm of PE50 tubing as stop | ||
5 mL syringe | BD Luer-Lock | 309646 | |
95% Oxygen/5% CO2 | AirGas | Z02OX9522000043 | |
Anethesia system | EZ Systems | EZ-SA800 | Can use any appropriate anethesia method/system |
Bovine Serum Albumin | Fisher BioReagents | BP-1600 | to coat tips of fine forcepts, scissors |
Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Chemical | C79-500 | |
Containers/dissection dishes | FisherBrand | 08-732-113 | Weigh dishes for creating dissection plates |
Crile Hemostat | Fine Science Tools | 13005-14 | for mouse gross dissection |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
Data acquisition software | SLControl | ||
Data acquisition system | MicrostarLabs | DAP5216a | Can use any DAQ. This is a PCI based data acqusition for use with SLControl; must have a PC with a PCI slot |
Data analysis software | Mathworks | Matlab | Custom Script |
Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | 2x for cannulation of aorta |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | 2x for trabecula isolation |
Experimental system | Aurora Scientific | 801C | Can use any appropriate experimental chamber with force and length control |
Fine Scissors, curved | Fine Science Tools | 14061-09 | for removal of heart |
Gooseneck Piggyback Illuminator | AmScope | LED-6WA | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
Imaging software | IrfanView | ||
Iris Forceps | World Precision Instruments | 15915 | for removal of heart |
Isoflurane | VetOne | 502017 | |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670-100G | |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
Mayo Scissors | Fine Science Tools | 14110-15 | for rat gross dissection |
Metzenbaum Scissors | Fine Science Tools | 14116-14 | for mouse gross dissection |
Microscope connected camera | Flir | BFS-U3-27S5M-C | Includes acquisition software |
Microscope/digital imaging system | Olympus | IX-73 | Can use any appropriate microscope. Needed to measure muscle length, cross sectional area |
Mounting Pin/Needle | BD PrecisionGlide | 305136 | For holding heart to dish. 27 G x 1-1/4 |
Mounting Pin/Needle | Fine Science Tools | 26000-40 | For holding heart to dish. 0.4mm diameter insect pin (Alt to 27G needle) |
Oxygen (O2) | AirGas | OX USP300 | |
Peristaltic Pump | Rainin | Rabbit | Can be any means to create flow in experimental chamber |
pH and Oxygen sensor | Mettler Toledo | SevenGo pH and DO | |
Potassium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 237205-100G | |
Potassium Chloride | Fisher Chemical | P217-500 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 795488-500G | |
Rochester-pean Hemostat | World Precision Instruments | 501708 | for rat gross dissection |
Silk Suture, Size: 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | cut to ~1.5 inch pieces, soaked in water |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-1KG | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | S7907-100G | |
Stereomicroscope | AmScope | SM-1TX | |
Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | for opening of the RV |
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 3097358-1004 | For creating dissection plates |
Syringe Holder | Harbor Frieght | Helping Hands 60501 | Can be used as alternate for ring stand |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625-1KG | |
Transfer Pipette | FisherBrand | 13-711-7M | cut ~1" from tip to widen bore |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | for trabecula isolation |