Snabb myokard- och hjärtavslappning är avgörande för normal fysiologi. Mekaniska avslappningsmekanismer är nu kända för att vara beroende av töjningshastigheten. Detta protokoll ger en översikt över förvärv och analys av experiment för att ytterligare studera den mekaniska kontrollen av avkoppling.
Diastolisk dysfunktion är en vanlig fenotyp över kardiovaskulära sjukdomspresentationer. Förutom förhöjd hjärtstyvhet (förhöjt slutdiastoliskt slutdiastoliskt tryck i vänster kammare) är nedsatt hjärtavslappning en viktig diagnostisk indikator på diastolisk dysfunktion. Medan avkoppling kräver avlägsnande av cytosoliskt kalcium och deaktivering av sarkomeriska tunna filament, har inriktning på sådana mekanismer ännu inte gett effektiva behandlingar. Mekaniska mekanismer, såsom blodtryck (dvs efterbelastning), har teoretiserats för att modifiera avslappning. Nyligen visade vi att modifiering av töjningshastigheten för en sträcka, inte efterbelastning, var både nödvändig och tillräcklig för att modifiera den efterföljande avslappningshastigheten för myokardvävnad. Spänningsberoendet av avkoppling, kallad mekanisk kontroll av avkoppling (MCR), kan bedömas med hjälp av intakta hjärttrabeculae. Detta protokoll beskriver beredningen av en liten djurmodell, experimentellt system och kammare, isolering av hjärtat och efterföljande isolering av en trabecula, förberedelse av experimentkammaren och experimentella och analysprotokoll. Bevis för att förlänga stammar i det intakta hjärtat tyder på att MCR kan ge nya arenor för bättre karakterisering av farmakologiska behandlingar, tillsammans med en metod för att bedöma myofilamentkinetik i intakta muskler. Därför kan studier av MCR belysa en väg till nya tillvägagångssätt och nya gränser vid behandling av hjärtsvikt.
Hjärtavslappningen är nedsatt vid nästan alla former av hjärtsvikt (inklusive hjärtsvikt med reducerad ejektionsfraktion) och vid många hjärt-kärlsjukdomar. Förutom många metoder för att utvärdera hjärtfunktionen i permeabiliserade muskler blir utvärderingen av intakta hjärtmuskler intressant. Sådana vävnader bedöms lossade (ändarna är fria att dra ihop sig) eller laddade (längd eller kraft kontrolleras). Historiskt har intakta isolerade myocyter utvärderats i ett obelastat tillstånd, där cellkroppen är fri att förkorta under sammandragning. Intakta hjärttrabeculae utvärderas ofta under isometriska förhållanden, där längden inte får ändras, men stress (kraft per tvärsnittsarea) genereras. Både intakta myocyt- och trabeculae-metoder börjar konvergera med modifieringar av belastning 1,2.
Protokoll för belastningsklämning av en muskel (dvs. kontroll av en muskels utvecklade spänning vid ett specificerat värde som simulerar fysiologiska efterbelastningar) har utvecklats under flera decennier 3,4,5. I intakta hjärtvävnader tillåter belastningsklämmor forskare att närmare efterlikna in vivo-hjärtcykeln med isotonisk eller Windkessel-liknande efterbelastning 6,7,8,9. Målet med detta protokoll är att erhålla data som används för att kvantifiera MCR (dvs. töjningsfrekvensberoendet av relaxeringshastigheten)8,9.
Medan MCR-protokollet har anpassats från tidigare arbete, är fokus för detta protokoll (jämfört med liknande protokoll som använder intakta hjärtvävnader) på biomekaniska mekanismer som modifierar avkoppling. Det finns flera protokoll som använder lastklämning 3,4,5,7,10 och protokoll som fokuserar på Windkessel-modellerna 1,2,11, men detta protokoll beskriver specifikt hur stretch före avkoppling modifierar avslappningshastigheten. Vi har visat att denna kontroll sker under en proto-diastolisk period8, en fas som ursprungligen beskrevs av Wiggers12. I normala friska hjärtan genomgår myokardiet en förlängande belastning under utstötning före stängning av aortaklaffen (dvs. före isovolumisk avkoppling)13. Detta efterliknas genom att förlänga varaktigheten av efterbelastningskontrollen tills muskeln börjar sträcka sig. Kliniska bevis tyder på att denna förlängning kan försvagas eller förloras i sjukdomstillstånd14, och konsekvenserna och mekanismerna för förändrade endsystoliska stamhastigheter har inte helt klarlagts. Med tanke på de glesa behandlingsalternativen för diastoliska sjukdomar och hjärtsvikt med en bevarad ejektionsfraktion, menar vi att MCR kan ge insikt i nya mekanismer som ligger bakom nedsatt avslappning.
Medan den grova dissektionen som beskrivs här fokuserar på gnagare, kan trabeculaisolering utföras från vilket intakt hjärta som helst och har tidigare använts med en human hjärttrabecula8. På samma sätt kan datainsamlingen och analysen också tillämpas på kardiomyocyter eller andra isolerade muskeltyper 1,10. Diskussionen innehåller kommentarer om möjliga förändringar och anpassningar av metoden, tillsammans med begränsningar, såsom försiktighet mot att använda papillära muskler på grund av de mekaniska egenskaperna hos chordae9.
Mekanisk kontroll av avslappning (MCR) kvantifierar beroendet av myokardavslappningshastigheten på muskelns spänningshastighetsom fortsätter avslappning 8,9. Töjningshastighet, snarare än efterbelastning, är både nödvändig och tillräcklig för att modifiera avkopplingshastigheten8. Eftersom interventioner för att modifiera kalciumhastigheten inte har visat sig avsevärt förbättra hjärtavslappning, kan mekanisk intervention ge nya insikter i mekanismen och ge en ny behandling för diastolisk dysfunktion.
Protokollet för att modifiera myokardbelastningshastigheten som beskrivs här använder en isoton belastningsklämma 8,9. En styrka hos den isotoniska belastningsklämman är den kvantitativa kontrollen av efterbelastningsspänningen. Windkessel-liknande protokoll kan användas för att ytterligare undersöka förändringar i efterbelastning, förspänning och hjärtarbete 2,6,7. En ramp som inte styrs av lastklämman kan också användas för att bättre isolera förändringen i töjning från töjningshastighet. Oavsett verkar efterbelastningen i sig inte vara en stark modifierare av avkopplingsgraden8.
Protokollet kan också anpassas för att närma sig mer fysiologiska förhållanden för temperatur och tempohastighet. De aktuella protokolldetaljerna användes för att visa förekomsten av MCR. Genomförande av experiment under fysiologiska förhållanden rekommenderas generellt beroende på experimentfrågan. Experiment som utförs vid 37 ° C, eller vid höga tempohastigheter, kan dock snabbare inducera rundown (skada) på muskeln. En lösning med förbättrad syrebärande kapacitet kan behövas. Vidare måste datainsamlingen kunna sampla längden och kraften tillräckligt snabbt för att lösa de snabba ryckningarna och ge återkopplingskontroll.
Det nuvarande protokollet beskriver inte mätningen av kalcium eller mätningen och kontrollen av sarkomerlängder. Kalciummätningar har behandlats i andra protokoll11, medan sarkomerlängdmätning kan läggas till med lämplig utrustning. Sarkomerlängdkontroll används inte i nuvarande MCR-studier, eftersom muskellängd är den mest korrelativa parametern till det kliniska tillståndet19. Ytterligare sarkomerlängdskontroll (kontra muskellängdskontroll) skulle ge specifika svar på kinetiska frågor, men det är osannolikt att det kommer att lägga till translationell kunskap på grund av variation mellan sarkomer och minsta förståelse av sarkomerlängdförändringar in vivo.
Tre experimentella överväganden belyses här för att öka reproducerbarheten av data.
För det första kan fristående hjärttrabeculae vara svåra att hitta hos vissa djur (opublicerade resultat och meddelanden). Medan ryckande muskler kan hittas hos de flesta råttor, är en rimlig framgångsgrad för att erhålla data från trabecula hos råttor en av tre. Trabecula framgång kan vara högre med Brown Norway x Lewis F1 råttor, som också har använts historiskt20 och rapporterats ha fler trabeculae (opublicerade meddelanden). För möss är framgångsgraden sannolikt lägre, med mindre än en av 10 förväntas för möss från en BL / 6-bakgrund; En högre frekvens förväntas dock för möss med FVBN-bakgrund (opublicerad kommunikation och observationer).
För det andra kan skador på musklerna minska produktionen. Om de utvecklade krafterna är mindre än 10 mN mm-2 vid 25 °C och 0,5 Hz pacing, kan utredare behöva utföra felsökning för att bedöma om oavsiktlig sträckning eller kontakt mellan metallpincett och muskler uppstår, om lösningar inte är ordentligt förberedda eller om pacing eller experimentell utrustning fungerar korrekt. Andra protokoll som använder intakt trabecula har föreslagit att använda Luer-lock-sprutor som överföringskärl11. Även om detta är möjligt, särskilt om användaren kontrollerar en mycket långsam flödeshastighet eller mindre muskelsegment, använder det nuvarande protokollet en mycket större borrningsöverföringspipett för att minimera eventuella skador. Ett annat steg där ischemisk skada kan uppstå är under dissektion. Aortan ska kanyleras och spolas med perfusionslösning inom 3 minuter efter det första buksnittet (råtta) eller cervikal dislokation (mus), liknande gränserna som anges i kardiomyocytisoleringsprotokoll21,22. Detta minimerar tiden då hjärtvävnaden inte utsätts för den kardioplegiliknande perfusionslösningen. Vidare producerar dissektioner som varar mer än 30 minuter i allmänhet inte ryckande trabecula. Således bör operatörerna öva snabb men noggrann dissektion för att minimera skador. En tvärsnittsarea över 0,2 mm 2 (2 x 10-7 m2) kan drabbas av kärnischemi20.
För det tredje bör det sätt på vilket muskler är fästa vid motor- och kraftgivaren beaktas. Detta protokoll fokuserar för närvarande på krokar och fristående trabeculae. Den ibland snabba belastningshastigheten för sträckan före avslappning kan få en muskel att glida om den inte fästs ordentligt, varför det nuvarande protokollet inte använder “korgar” för att hålla trabecula23,24. Alternativa monteringsmetoder (lim, klämmor etc25,26) kan också övervägas och valideras. Protokollet som beskrivs här använder trabeculae och inte papillära muskler. Papillärmuskelns ackordae inducerar en serieelasticitet som kan hämma förändringar i MCR9. Det är dock osannolikt att den exakta placeringen av fästena i muskeln påverkar åtgärderna, eftersom trabeculalängden (och diametern) varierar avsevärt.
En begränsning med att genomborra muskeländarna med krokar är att själva monteringspunkten också kan skadas. Möjlig rivning av den fästa muskelvävnaden med frekventa sammandragningar (beroende på deras styrka) kan ändra längden eller seriens elasticitet. Denna rivhastighet är svår att kontrollera. På samma sätt kan skador på vävnaden och kroken förvärras under sträckning, vilket också kan orsaka problem. Okulär inspektion och de utvecklade kraftvärden som återstår >80% av den jämviktade isometriska kraften bör användas för att bedöma om preparatet är skadat och bör uteslutas.
En annan begränsning eller övervägande påverkar vilka experimentella frågor som kan besvaras med metoden. Tänk till exempel på användningen av 2,3-butandionmonoxim (BDM) i perfusionslösningen. BDM är ett fosfatas, vilket kan förändra muskelns funktion. Dessutom innebär den långa lossningsperioden och bristen på pacing att det latenta fosforyleringstillståndet sannolikt har förändrats. Således bör försiktighet iakttas om man försöker direkt bedöma ett djurs muskelkontraktilitet (jämfört med skillnader mellan genotyper eller behandlingar), eftersom kontraktiltillståndet sannolikt har förändrats. Effekten av fosforylering kan dock bedömas farmakologiskt genom tillägg av en agonist eller antagonist till vägen.
Sammanfattningsvis ger MCR insikt i hur avslappning regleras av muskelrörelser (töjningshastighet). MCR kan bidra till att ge bättre insikt i diagnos och övervakning av diastolisk sjukdom, tillsammans med mål för farmakologisk intervention, såsom modifiering av myosinkinetik. Protokollet och råden som beskrivs här beskriver kunskap som utvecklats under flera års försök och bör vara tillämpliga på andra system och modeller av hjärtsjukdom.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av National Institutes of Health (1R01HL151738) och American Heart Association (18TPA34170169).
18 or 16 gauge blunted needle/canula | for cannulation of rat aorta, use 1mm of PE160 or PE205 tubing as stop | ||
2,3-Butanedione Monoxime | Sigma-Aldrich | B0753-25G | |
23 gauge blunted needle/canula | for cannulation of mouse aorta, use 1mm of PE50 tubing as stop | ||
5 mL syringe | BD Luer-Lock | 309646 | |
95% Oxygen/5% CO2 | AirGas | Z02OX9522000043 | |
Anethesia system | EZ Systems | EZ-SA800 | Can use any appropriate anethesia method/system |
Bovine Serum Albumin | Fisher BioReagents | BP-1600 | to coat tips of fine forcepts, scissors |
Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Chemical | C79-500 | |
Containers/dissection dishes | FisherBrand | 08-732-113 | Weigh dishes for creating dissection plates |
Crile Hemostat | Fine Science Tools | 13005-14 | for mouse gross dissection |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
Data acquisition software | SLControl | ||
Data acquisition system | MicrostarLabs | DAP5216a | Can use any DAQ. This is a PCI based data acqusition for use with SLControl; must have a PC with a PCI slot |
Data analysis software | Mathworks | Matlab | Custom Script |
Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | 2x for cannulation of aorta |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | 2x for trabecula isolation |
Experimental system | Aurora Scientific | 801C | Can use any appropriate experimental chamber with force and length control |
Fine Scissors, curved | Fine Science Tools | 14061-09 | for removal of heart |
Gooseneck Piggyback Illuminator | AmScope | LED-6WA | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
Imaging software | IrfanView | ||
Iris Forceps | World Precision Instruments | 15915 | for removal of heart |
Isoflurane | VetOne | 502017 | |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670-100G | |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
Mayo Scissors | Fine Science Tools | 14110-15 | for rat gross dissection |
Metzenbaum Scissors | Fine Science Tools | 14116-14 | for mouse gross dissection |
Microscope connected camera | Flir | BFS-U3-27S5M-C | Includes acquisition software |
Microscope/digital imaging system | Olympus | IX-73 | Can use any appropriate microscope. Needed to measure muscle length, cross sectional area |
Mounting Pin/Needle | BD PrecisionGlide | 305136 | For holding heart to dish. 27 G x 1-1/4 |
Mounting Pin/Needle | Fine Science Tools | 26000-40 | For holding heart to dish. 0.4mm diameter insect pin (Alt to 27G needle) |
Oxygen (O2) | AirGas | OX USP300 | |
Peristaltic Pump | Rainin | Rabbit | Can be any means to create flow in experimental chamber |
pH and Oxygen sensor | Mettler Toledo | SevenGo pH and DO | |
Potassium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 237205-100G | |
Potassium Chloride | Fisher Chemical | P217-500 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 795488-500G | |
Rochester-pean Hemostat | World Precision Instruments | 501708 | for rat gross dissection |
Silk Suture, Size: 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | cut to ~1.5 inch pieces, soaked in water |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-1KG | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | S7907-100G | |
Stereomicroscope | AmScope | SM-1TX | |
Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | for opening of the RV |
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 3097358-1004 | For creating dissection plates |
Syringe Holder | Harbor Frieght | Helping Hands 60501 | Can be used as alternate for ring stand |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625-1KG | |
Transfer Pipette | FisherBrand | 13-711-7M | cut ~1" from tip to widen bore |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | for trabecula isolation |