Akciğer Kaynaklı Örneklerden Mikrovasküler ve Makrovasküler Endotel Hücre İzolasyonu ve Saflaştırma
Summary
Zor olmasına rağmen, pulmoner endotel hücrelerinin izolasyonu, akciğer iltihabı ile ilgili çalışmalar için gereklidir. Bu protokol, makrovasküler ve mikrovasküler endotel hücrelerinin yüksek verimli, yüksek saflıkta izolasyonu için bir prosedürü tanımlamaktadır.
Abstract
Sağlıklı ve hastalıklı doku ve organlardan izole edilen hücrelerin mevcudiyeti, kişiselleştirilmiş tıp yaklaşımları için kilit bir unsurdur. Biyobankalar, biyomedikal araştırmalar için geniş bir birincil ve ölümsüzleştirilmiş hücre koleksiyonu sağlayabilse de, bunlar tüm deneysel ihtiyaçları, özellikle de belirli hastalıklar veya genotiplerle ilgili olanları kapsamaz. Vasküler endotel hücreleri (ECs), immün inflamatuar reaksiyonun anahtar bileşenleridir ve bu nedenle çeşitli hastalıkların patogenezinde merkezi bir rol oynamaktadır. Özellikle, farklı bölgelerden gelen EC’ler farklı biyokimyasal ve fonksiyonel özellikler göstererek, güvenilir deneyler tasarlamak için spesifik EC tiplerinin (yani makrovasküler, mikrovasküler, arteriyel ve venöz) kullanılabilirliğini gerekli kılar. Burada, pulmoner arter ve akciğer parankiminden yüksek verimli, neredeyse saf insan makrovasküler ve mikrovasküler endotel hücreleri elde etmek için basit prosedürler ayrıntılı olarak gösterilmiştir. Bu metodoloji, ticari kaynaklardan bağımsızlık elde etmek ve henüz mevcut olmayan EC fenotiplerini / genotiplerini elde etmek için herhangi bir laboratuvar tarafından nispeten düşük bir maliyetle kolayca çoğaltılabilir.
Introduction
Vasküler endotel, kan damarlarının iç yüzeyini kaplar. Kan pıhtılaşmasının, vasküler tonusun ve immün-inflamatuar yanıtların düzenlenmesinde anahtar rol oynar 1,2,3,4. İnsan örneklerinden izole edilen endotel hücrelerinin (ECs) kültürü araştırma amaçları için gerekli olmasına rağmen, farklı kan damarlarından (arterler, damarlar, kılcal damarlar) gelen EC’lerin spesifik işlevleri olduğu belirtilmelidir. Bunlar, vasküler endotel patofizyolojisi ile ilgili çalışmalarda kolayca bulunabilen ve yaygın olarak kullanılan insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC) tarafından tam olarak özetlenemez 5,6. Örneğin, insan akciğer mikrovasküler endotel hücreleri (HLMVEC’ler), lökosit alımını ve birikimini kontrol ederek akciğer iltihabında anahtar rol oynamaktadır 4,7. Bu nedenle, akciğer iltihabını yüksek doğrulukla çoğaltmayı amaçlayan deneysel bir ortam, HLMVEC’leri içermelidir. Öte yandan, EC disfonksiyonu çeşitli patolojilerde görülebilir; Bu nedenle, hastadan alınan ECs, hastalığın güvenilir bir in vitro modelini oluşturmak için esastır. Örneğin, kistik fibrozdan (KF) etkilenen kişilerin eksplante akciğerlerinden diseke edilen ECs fragmanlarının pulmoner arterden (HPAEC’ler) izole edilmesi, bu hastalıkta endotel disfonksiyonunun mekanizmalarını ortaya çıkarmamızı sağlamıştır 8,9.
Bu nedenle, hastalık durumlarında da EC’lerin farklı kaynaklardan / organlardan izolasyonunu optimize etmeyi amaçlayan protokoller, araştırmacılara, özellikle bu araçlar ticari olarak mevcut olmadığında, değerli araştırma araçları sağlamak için gereklidir. HLMVEC ve HPAEC izolasyon protokolleri daha önce 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 olarak bildirilmiştir. Her durumda, akciğer örneklerinin enzimatik sindirimi, geçici seçici ortam ve manyetik boncuklar veya sitometrik tabanlı hücre sıralama kullanılarak saflaştırılan karışık hücre popülasyonları ile sonuçlandı. Bu protokollerin daha fazla optimizasyonu, EC izolasyonundaki iki ana konuyu ele almalıdır: (1) EC replikatif yaşlanmasını en aza indirmek için mümkün olan en erken kültür pasajlarında çözülmesi gereken hücre ve doku kontaminasyonu20; ve (2) birincil EC izolatlarının düşük verimi.
Bu çalışma, HLMVEC’lerin ve HPAEC’lerin yüksek verimli, yüksek saflıkta izolasyonu için yeni bir protokolü açıklamaktadır. Bu prosedür kolayca uygulanabilir ve birkaç adımda neredeyse saf makrovasküler ve mikrovasküler ECs verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vasküler endotel hücrelerinin insan patofizyolojisinde oynadığı çoklu roller, bu hücreleri in vitro patogenetik ve farmakolojik çalışmalar için vazgeçilmez bir araç haline getirmektedir. Farklı vasküler bölgelerden/organlardan gelen EC’ler kendine özgü özellikler ve işlevler gösterdiğinden, ilgili organdan sağlıklı ve hastalıklı ECs’lerin mevcudiyeti araştırma amaçları için ideal olacaktır. Örneğin, HLMVEC’ler akciğer iltihabı ile ilgili çalışmalar için gereklidir; Bu ned…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, İtalya Üniversite ve Araştırma Bakanlığı’ndan (eski% 60 2021 ve 2022) R. P.’ye ve İtalyan Kistik Fibroz Vakfı’ndan (FFC # 23 / 2014) ve İtalya Sağlık Bakanlığı’ndan (L548 / 93) MR’ye verilen hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | Used to detach cells from the culture plates |
| Anti CD31 Antibody, clone WM59 | Dako | M0823 | Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50 |
| Anti vWF Antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-14029 | Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100 |
| Autoclavable surgical scissors | Any | Used for chopping specimens | |
| Cell strainers 40 µm | Corning | 431750 | Used during the second filtration |
| Cell strainers 70 µm | Corning | 431751 | Using during the first filtration |
| Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004177 | Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL |
| Conjugated anti CD31 Antibody | BD Biosciences | 555445 | Used for cell sorting (1:20 dilution) |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing before medium change |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | HLMVEC growth medium |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G2500 | Used for plate coating |
| Type A gelatin | Sigma-Aldrich | g-2500 | Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5% |
References
- Muller, W. A. Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response. Trends in Immunology. 24 (6), 326-333 (2003).
- Sumpio, B. E., Timothy Riley, J., Dardik, A. Cells in focus: Endothelial cell. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 34 (12), 1508-1512 (2002).
- Lüscher, T. F., Tanner, F. C. Endothelial regulation of vascular tone and growth. American Journal of Hypertension. 6, 283-293 (1993).
- Marki, A., Esko, J. D., Pries, A. R., Ley, K. Role of the endothelial surface layer in neutrophil recruitment. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 503-515 (2015).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. W. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Journal of Visualized Experiments. (3), e183 (2007).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), e4032 (2012).
- Dejana, E., Corada, M., Lampugnani, M. G. Endothelial cell-to-cell junctions. FASEB Journal. 9 (10), 910-918 (1995).
- Plebani, R., et al. Establishment and long-term culture of human cystic fibrosis endothelial cells. Laboratory Investigation. 97 (11), 1375-1384 (2017).
- Totani, L., et al. Mechanisms of endothelial cell dysfunction in cystic fibrosis. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (12), 3243-3253 (2017).
- Gaskill, C., Majka, S. M. A high-yield isolation and enrichment strategy for human lung microvascular endothelial cells. Pulmonary Circulation. 7 (1), 108-116 (2017).
- Hewett, P. W. Isolation and culture of human endothelial cells from micro- and macro-vessels. Methods in Molecular Biology. 1430, 61 (2016).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Comhair, S. A. A., et al. Human primary lung endothelial cells in culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (6), 723-730 (2012).
- Visner, G. A., et al. Isolation and maintenance of human pulmonary artery endothelial cells in culture isolated from transplant donors. The American Journal of Physiology. 267, 406-413 (1994).
- Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory Research. 14 (1), 23 (2013).
- Ventetuolo, C. E., et al. Culture of pulmonary artery endothelial cells from pulmonary artery catheter balloon tips: considerations for use in pulmonary vascular disease. The European Respiratory Journal. 55 (3), 1901313 (2020).
- Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458 (2019).
- Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J. Isolation of primary mouse lung endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (177), e63253 (2021).
- Kraan, J., et al. Endothelial CD276 (B7-H3) expression is increased in human malignancies and distinguishes between normal and tumour-derived circulating endothelial cells. British Journal of Cancer. 111 (1), 149-156 (2014).
- Khan, S. Y., et al. Premature senescence of endothelial cells upon chronic exposure to TNFα can be prevented by N-acetyl cysteine and plumericin. Scientific Reports. 7 (1), 39501 (2017).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Miron, R. J., Chai, J., Fujioka-Kobayashi, M., Sculean, A., Zhang, Y. Evaluation of 24 protocols for the production of platelet-rich fibrin. BMC Oral Health. 20 (1), 310 (2020).
- Lenting, P. J., Christophe, O. D., Denis, C. V. von Willebrand factor biosynthesis, secretion, and clearance: Connecting the far ends. Blood. 125 (13), 2019-2028 (2015).
- Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-lot variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
- Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. 21 (4), 606-615 (2021).
