Isolement et purification de cellules endothéliales microvasculaires et macrovasculaires à partir d’échantillons dérivés de poumons
Summary
Bien que difficile, l’isolement des cellules endothéliales pulmonaires est essentiel pour les études sur l’inflammation pulmonaire. Le présent protocole décrit une procédure pour l’isolement à haut rendement et à haute pureté des cellules endothéliales macrovasculaires et microvasculaires.
Abstract
La disponibilité de cellules isolées à partir de tissus et d’organes sains et malades représente un élément clé pour les approches de médecine personnalisée. Bien que les biobanques puissent fournir une vaste collection de cellules primaires et immortalisées pour la recherche biomédicale, celles-ci ne couvrent pas tous les besoins expérimentaux, en particulier ceux liés à des maladies ou à des génotypes spécifiques. Les cellules endothéliales vasculaires (CE) sont des composants clés de la réaction inflammatoire immunitaire et, par conséquent, jouent un rôle central dans la pathogenèse d’une variété de troubles. Notamment, les EC de différents sites présentent des propriétés biochimiques et fonctionnelles différentes, ce qui rend la disponibilité de types de CE spécifiques (c.-à-d. macrovasculaire, microvasculaire, artériel et veineux) essentielle pour concevoir des expériences fiables. Ici, des procédures simples pour obtenir des cellules endothéliales macrovasculaires et microvasculaires humaines à haut rendement et pratiquement pures à partir de l’artère pulmonaire et du parenchyme pulmonaire sont illustrées en détail. Cette méthodologie peut être facilement reproduite à un coût relativement faible par n’importe quel laboratoire pour obtenir l’indépendance vis-à-vis des sources commerciales et obtenir des phénotypes/génotypes EC qui ne sont pas encore disponibles.
Introduction
L’endothélium vasculaire tapisse la surface interne des vaisseaux sanguins. Il joue un rôle clé dans la régulation de la coagulation sanguine, du tonus vasculaire et des réponses immuno-inflammatoires 1,2,3,4. Bien que la culture de cellules endothéliales (CE) isolées à partir de spécimens humains soit essentielle à des fins de recherche, il faut remarquer que les CE de différents vaisseaux sanguins (artères, veines, capillaires) ont des fonctions spécifiques. Celles-ci ne peuvent pas être entièrement récapitulées par les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC), qui sont facilement disponibles et largement utilisées dans les études sur la physiopathologie de l’endothélium vasculaire 5,6. Par exemple, les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires humaines (HLMVEC) jouent un rôle clé dans l’inflammation pulmonaire en contrôlant le recrutement et l’accumulationdes leucocytes 4,7. Ainsi, un cadre expérimental visant à reproduire l’inflammation pulmonaire avec une haute fidélité devrait inclure les HLMVEC. D’autre part, un dysfonctionnement EC peut être observé dans plusieurs pathologies; par conséquent, les CE du patient sont fondamentales pour construire un modèle in vitro fiable de la maladie. Par exemple, l’isolement de fragments d’EC de l’artère pulmonaire (HPAEC), disséqués à partir des poumons explantés de personnes atteintes de mucoviscidose (FK), nous a permis de découvrir des mécanismes de dysfonctionnement endothélial dans cette maladie 8,9.
Ainsi, les protocoles visant à optimiser l’isolement des CE provenant de différentes sources/organes, y compris dans des états pathologiques, sont essentiels pour fournir aux chercheurs des outils de recherche précieux, en particulier lorsque ces outils ne sont pas disponibles dans le commerce. Des protocoles d’isolement HLMVEC et HPAEC ont déjà été signalés 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Dans tous les cas, la digestion enzymatique des échantillons pulmonaires a donné lieu à des populations cellulaires mixtes, qui ont été purifiées à l’aide de milieux sélectifs ad hoc et d’un tri cellulaire à base de billes magnétiques ou cytométriques. D’autres optimisations de ces protocoles doivent aborder deux problèmes principaux dans l’isolement de la CU : (1) la contamination des cellules et des tissus, qui devrait être résolue le plus tôt possible pour minimiser la sénescence réplicative EC20 ; et 2) le faible rendement des isolats CE primaires.
Cette étude décrit un nouveau protocole pour l’isolement à haut rendement et à haute pureté des HLMVECs et des HPAEC. Cette procédure peut être facilement applicable et donner des CE macrovasculaires et microvasculaires pratiquement purs en quelques étapes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les multiples rôles joués par les cellules endothéliales vasculaires dans la physiopathologie humaine font de ces cellules un outil indispensable pour les études pathogéniques et pharmacologiques in vitro . Étant donné que les EC de différents sites / organes vasculaires présentent des caractéristiques et des fonctions particulières, la disponibilité de CE saines et malades de l’organe d’intérêt serait idéale à des fins de recherche. Par exemple, les HLMVECs sont essentiels pour les études s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des fonds du ministère italien de l’Université et de la Recherche (ex 60% 2021 et 2022) à R. P. et par des subventions de la Fondation italienne de la mucoviscidose (FFC # 23 / 2014) et du ministère italien de la Santé (L548/93) à M. R.
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | Used to detach cells from the culture plates |
| Anti CD31 Antibody, clone WM59 | Dako | M0823 | Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50 |
| Anti vWF Antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-14029 | Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100 |
| Autoclavable surgical scissors | Any | Used for chopping specimens | |
| Cell strainers 40 µm | Corning | 431750 | Used during the second filtration |
| Cell strainers 70 µm | Corning | 431751 | Using during the first filtration |
| Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004177 | Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL |
| Conjugated anti CD31 Antibody | BD Biosciences | 555445 | Used for cell sorting (1:20 dilution) |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing before medium change |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | HLMVEC growth medium |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G2500 | Used for plate coating |
| Type A gelatin | Sigma-Aldrich | g-2500 | Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5% |
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