Mikrovaskuläre und makrovaskuläre Endothelzellisolierung und -reinigung aus Lungenproben
Summary
Obwohl die Isolierung von pulmonalen Endothelzellen eine Herausforderung darstellt, ist sie für Studien zur Lungenentzündung unerlässlich. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur hochwirksamen, hochreinen Isolierung von makrovaskulären und mikrovaskulären Endothelzellen.
Abstract
Die Verfügbarkeit von Zellen, die aus gesunden und kranken Geweben und Organen isoliert wurden, stellt ein Schlüsselelement für Ansätze der personalisierten Medizin dar. Obwohl Biobanken eine große Sammlung von primären und immortalisierten Zellen für die biomedizinische Forschung bereitstellen können, decken diese nicht alle experimentellen Bedürfnisse ab, insbesondere nicht solche, die sich auf bestimmte Krankheiten oder Genotypen beziehen. Vaskuläre Endothelzellen (ECs) sind Schlüsselkomponenten der immunen Entzündungsreaktion und spielen daher eine zentrale Rolle in der Pathogenese einer Vielzahl von Erkrankungen. Bemerkenswert ist, dass ECs von verschiedenen Standorten unterschiedliche biochemische und funktionelle Eigenschaften aufweisen, so dass die Verfügbarkeit spezifischer EC-Typen (d. h. makrovaskulär, mikrovaskulär, arteriell und venös) für die Planung zuverlässiger Experimente unerlässlich ist. Hier werden einfache Verfahren zur Gewinnung hochergiebiger, nahezu reiner humaner makrovaskulärer und mikrovaskulärer Endothelzellen aus der Pulmonalarterie und dem Lungenparenchym detailliert dargestellt. Diese Methodik kann von jedem Labor zu relativ geringen Kosten leicht reproduziert werden, um Unabhängigkeit von kommerziellen Quellen zu erreichen und EC-Phänotypen/Genotypen zu erhalten, die noch nicht verfügbar sind.
Introduction
Das vaskuläre Endothel kleidet die innere Oberfläche der Blutgefäße aus. Es spielt eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Blutgerinnung, des Gefäßtonus und der immuninflammatorischen Reaktionen 1,2,3,4. Obwohl die Kultivierung von Endothelzellen (ECs), die aus menschlichen Proben isoliert wurden, für Forschungszwecke unerlässlich ist, muss beachtet werden, dass die ECs aus verschiedenen Blutgefäßen (Arterien, Venen, Kapillaren) spezifische Funktionen haben. Diese können von humanen Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC), die leicht verfügbar sind und in Studien zur Pathophysiologie des vaskulären Endothels weit verbreitet sind, nicht vollständig rekapituliert werden 5,6. So spielen beispielsweise humane mikrovaskuläre Endothelzellen der Lunge (HLMVECs) eine Schlüsselrolle bei Lungenentzündungen, indem sie die Rekrutierung und Akkumulation von Leukozyten kontrollieren 4,7. Daher sollte ein experimentelles Setting, das darauf abzielt, Lungenentzündungen mit hoher Genauigkeit zu reproduzieren, HLMVECs umfassen. Auf der anderen Seite kann eine EC-Dysfunktion bei mehreren Pathologien beobachtet werden; Daher sind ECs des Patienten von grundlegender Bedeutung, um ein zuverlässiges In-vitro-Modell der Krankheit zu erstellen. So konnten wir beispielsweise durch die Isolierung von EC-Fragmenten aus der Pulmonalarterie (HPAECs), die aus der explantierten Lunge von Mukoviszidose-Patienten (Mukoviszidose) entnommen wurden, Mechanismen der endothelialen Dysfunktion bei dieser Erkrankung aufdecken 8,9.
Daher sind Protokolle, die darauf abzielen, die Isolierung von ECs aus verschiedenen Quellen/Organen auch in Krankheitsstadien zu optimieren, unerlässlich, um Forschern wertvolle Forschungswerkzeuge zur Verfügung zu stellen, insbesondere wenn diese Werkzeuge nicht kommerziell erhältlich sind. HLMVEC- und HPAEC-Isolationsprotokolle wurden bereits berichtet 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. In allen Fällen führte der enzymatische Aufschluss der Lungenproben zu gemischten Zellpopulationen, die mit Hilfe von Ad-hoc-Selektionsmedien und magnetischer Beads- oder zytometrischer Zellsortierung aufgereinigt wurden. Weitere Optimierungen dieser Protokolle müssen zwei Hauptprobleme bei der EC-Isolierung angehen: (1) Zell- und Gewebekontamination, die zum frühestmöglichen Zeitpunkt behoben werden sollte, um die replikative Seneszenz der ECzu minimieren 20; und (2) die geringe Ausbeute an primären EC-Isolaten.
In dieser Arbeit wird ein neues Protokoll für die hochreine Isolierung von HLMVECs und HPAECs mit hoher Ausbeute und Reinheit beschrieben. Dieses Verfahren ist einfach anwendbar und liefert in wenigen Schritten nahezu reine makrovaskuläre und mikrovaskuläre ECs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die vielfältigen Rollen, die vaskuläre Endothelzellen in der humanen Pathophysiologie spielen, machen diese Zellen zu einem unverzichtbaren Werkzeug für pathogenetische und pharmakologische In-vitro-Studien . Da ECs aus verschiedenen Gefäßstellen/Organen besondere Merkmale und Funktionen aufweisen, wäre die Verfügbarkeit von gesunden und kranken ECs aus dem interessierenden Organ ideal für Forschungszwecke. Zum Beispiel sind HLMVECs für Studien zu Lungenentzündungen unerlässlich; Daher wird eine Metho…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Mittel des italienischen Ministeriums für Universität und Forschung (ex 60% 2021 und 2022) an R. P. und durch Zuschüsse der italienischen Mukoviszidose-Stiftung (FFC#23/2014) und des italienischen Gesundheitsministeriums (L548/93) an M. R. unterstützt.
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | Used to detach cells from the culture plates |
| Anti CD31 Antibody, clone WM59 | Dako | M0823 | Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50 |
| Anti vWF Antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-14029 | Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100 |
| Autoclavable surgical scissors | Any | Used for chopping specimens | |
| Cell strainers 40 µm | Corning | 431750 | Used during the second filtration |
| Cell strainers 70 µm | Corning | 431751 | Using during the first filtration |
| Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004177 | Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL |
| Conjugated anti CD31 Antibody | BD Biosciences | 555445 | Used for cell sorting (1:20 dilution) |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing before medium change |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | HLMVEC growth medium |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G2500 | Used for plate coating |
| Type A gelatin | Sigma-Aldrich | g-2500 | Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5% |
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