Isolamento e Purificação de Células Endoteliais Microvasculares e Macrovasculares a partir de Amostras Derivadas de Pulmão
Summary
Apesar de desafiador, o isolamento das células endoteliais pulmonares é essencial para estudos sobre inflamação pulmonar. O presente protocolo descreve um procedimento para o isolamento de alto rendimento e pureza de células endoteliais macrovasculares e microvasculares.
Abstract
A disponibilidade de células isoladas de tecidos e órgãos saudáveis e doentes representa um elemento-chave para abordagens de medicina personalizada. Embora os biobancos possam fornecer uma ampla coleção de células primárias e imortalizadas para pesquisa biomédica, estes não cobrem todas as necessidades experimentais, particularmente aquelas relacionadas a doenças ou genótipos específicos. As células endoteliais vasculares (CEs) são componentes-chave da reação inflamatória imune e, portanto, desempenham um papel central na patogênese de uma variedade de doenças. Notavelmente, CE de diferentes sítios exibem diferentes propriedades bioquímicas e funcionais, tornando a disponibilidade de tipos específicos de CE (isto é, macrovascular, microvascular, arterial e venosa) essencial para o planejamento de experimentos confiáveis. Aqui, procedimentos simples para a obtenção de células endoteliais macrovasculares e microvasculares humanas de alto rendimento, virtualmente puras, da artéria pulmonar e do parênquima pulmonar são ilustrados em detalhes. Esta metodologia pode ser facilmente reproduzida a um custo relativamente baixo por qualquer laboratório para alcançar independência de fontes comerciais e obter fenótipos/genótipos CE que ainda não estão disponíveis.
Introduction
O endotélio vascular reveste a superfície interna dos vasos sanguíneos. Desempenha papéis fundamentais na regulação da coagulação sanguínea, do tônus vascular e da resposta imune-inflamatória 1,2,3,4. Embora a cultura de células endoteliais (CEs) isoladas de espécimes humanos seja essencial para fins de pesquisa, deve-se ressaltar que as CE de diferentes vasos sanguíneos (artérias, veias, capilares) têm funções específicas. Estas não podem ser totalmente recapituladas pelas células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC), que são facilmente disponíveis e amplamente utilizadas em estudos sobre a fisiopatologia do endotéliovascular5,6. Por exemplo, as células endoteliais microvasculares pulmonares humanas (HLMVECs) desempenham papéis fundamentais na inflamação pulmonar, controlando o recrutamento e o acúmulo de leucócitos 4,7. Assim, um cenário experimental que vise reproduzir a inflamação pulmonar com alta fidelidade deve incluir os HLMVECs. Por outro lado, a disfunção do CE pode ser observada em diversas patologias; portanto, as CE do paciente são fundamentais para a construção de um modelo in vitro confiável da doença. Por exemplo, o isolamento de fragmentos de CE da artéria pulmonar (CEAP), dissecados dos pulmões explantados de pessoas acometidas pela fibrose cística (FC), permitiu desvendar mecanismos de disfunção endotelial nessa doença 8,9.
Assim, protocolos que visem otimizar o isolamento de CEs de diferentes fontes/órgãos também em estados patológicos são essenciais para fornecer aos investigadores ferramentas valiosas de pesquisa, particularmente quando essas ferramentas não estão disponíveis comercialmente. Protocolos de isolamento de HLMVEC e HPAEC foram previamente relatados 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Em todos os casos, a digestão enzimática dos espécimes pulmonares resultou em populações de células mistas, que foram purificadas usando meios seletivos ad hoc e classificação celular baseada em esferas magnéticas ou citométricas. Otimizações adicionais desses protocolos devem abordar duas questões principais no isolamento da CE: (1) contaminação celular e tecidual, que deve ser resolvida o mais cedo possível para minimizar a senescência replicativa da CE20; e (2) o baixo rendimento de isolados primários de CE.
Este estudo descreve um novo protocolo para o isolamento de alto rendimento e alta pureza de HLMVECs e HPAECs. Este procedimento pode ser facilmente aplicável e fornecer CE macrovascular e microvascular virtualmente puras em poucos passos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os múltiplos papéis desempenhados pelas células endoteliais vasculares na fisiopatologia humana fazem dessas células uma ferramenta indispensável para estudos patogênicos e farmacológicos in vitro . Uma vez que CEs de diferentes sítios/órgãos vasculares apresentam características e funções peculiares, a disponibilidade de CE saudáveis e doentes do órgão de interesse seria ideal para fins de pesquisa. Por exemplo, os HLMVECs são essenciais para estudos sobre inflamação pulmonar; Portanto, uma m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por fundos do Ministério Italiano da Universidade e Pesquisa (ex 60% 2021 e 2022) para R. P. e por subsídios da Fundação Italiana de Fibrose Cística (FFC#23/2014) e do Ministério da Saúde italiano (L548/93) para M. R.
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | Used to detach cells from the culture plates |
| Anti CD31 Antibody, clone WM59 | Dako | M0823 | Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50 |
| Anti vWF Antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-14029 | Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100 |
| Autoclavable surgical scissors | Any | Used for chopping specimens | |
| Cell strainers 40 µm | Corning | 431750 | Used during the second filtration |
| Cell strainers 70 µm | Corning | 431751 | Using during the first filtration |
| Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004177 | Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL |
| Conjugated anti CD31 Antibody | BD Biosciences | 555445 | Used for cell sorting (1:20 dilution) |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing before medium change |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | HLMVEC growth medium |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G2500 | Used for plate coating |
| Type A gelatin | Sigma-Aldrich | g-2500 | Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5% |
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