Tumoren van het centrale zenuwstelsel (CZS) zijn de belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfte bij kinderen, en locoregionale immuungebaseerde therapieën worden steeds vaker getest voor patiënten in klinische onderzoeken. Dit protocol beschrijft methoden voor locoregionale canule-implantatie bij muizen voor de preklinische evaluatie van immunotherapeutische infusies gericht op CZS-tumoren.
Pediatrische CZS-tumoren zijn verantwoordelijk voor de meerderheid van de kankergerelateerde sterfgevallen bij kinderen en hebben slechte prognoses, ondanks vooruitgang in chemotherapie en radiotherapie. Omdat veel tumoren geen effectieve behandelingen hebben, is er een cruciale behoefte om meer veelbelovende therapeutische opties te ontwikkelen, zoals immunotherapieën; het gebruik van chimere antigeenreceptor (CAR) T-celtherapie gericht tegen CZS-tumoren is van bijzonder belang. Celoppervlakdoelen zoals B7-H3, IL13RA2 en de disialoganglioside GD2 komen sterk tot expressie op het oppervlak van verschillende pediatrische en volwassen CZS-tumoren, waardoor de mogelijkheid om CAR T-celtherapie te gebruiken tegen deze en andere oppervlaktedoelen toeneemt. Om de herhaalde locoregionale afgifte van CAR T-cellen in preklinische muizenmodellen te evalueren, werd een verblijfskathetersysteem opgezet dat verblijfskatheters samenvat die momenteel worden gebruikt in klinische proeven bij mensen. In tegenstelling tot stereotactische toediening, maakt het verblijfskathetersysteem herhaalde dosering mogelijk zonder het gebruik van meerdere operaties. Dit protocol beschrijft de intratumorale plaatsing van een vaste geleidecanule die is gebruikt om seriële CAR T-celinfusies met succes te testen in orthotopische muizenmodellen van pediatrische hersentumoren. Na orthotopische injectie en engraftment van de tumorcellen bij muizen, wordt intratumorale plaatsing van een vaste geleidecanule voltooid op een stereotactisch apparaat en vastgezet met schroeven en acrylhars. Behandelingscanules worden vervolgens ingebracht via de vaste geleidecanule voor herhaalde CAR T-celafgifte. Stereotactische plaatsing van de geleidecanule kan worden aangepast om CAR T-cellen rechtstreeks in de laterale ventrikel of andere locaties in de hersenen af te leveren. Dit platform biedt een betrouwbaar mechanisme voor het preklinisch testen van herhaalde intracraniale infusies van CAR T-cellen en andere nieuwe therapieën voor deze verwoestende pediatrische tumoren.
Ondanks verbeteringen in chemotherapie, radiotherapie en chirurgie, zijn tumoren van het centrale zenuwstelsel (CZS) de dodelijkste maligniteit in de kindergeneeskunde1, wat een belangrijke behoefte aan nieuwe benaderingen met meer succesvolle resultaten onderstreept. Met aanzienlijke vooruitgang op het gebied van immunotherapie, hebben adoptieve cellulaire therapie (ACT) benaderingen veelbelovende resultaten laten zien bij verschillende kankers, met name hematologische maligniteiten2. Chimere antigeenreceptor (CAR) T-celtherapie, een specifiek type ACT, maakt gebruik van het natuurlijke vermogen van het immuunsysteem om schadelijke cellen te herkennen en te doden door de specificiteit van T-cellen om te leiden om tumorgerichte T-cellen te genereren3. CAR T-celtherapie heeft aanzienlijk succes aangetoond bij de behandeling van leukemieën en lymfomen4, waardoor het een veelbelovende immunotherapeutische benadering is en het onderzoek naar solide tumoren wordt aangemoedigd. Tot nu toe heeft CAR T-celtherapie in solide tumoren echter weinig klinisch succes geboekt en wordt het geconfronteerd met vele uitdagingen, zoals inefficiënte tumorpenetratie, beperkte targetable antigenen en de onderdrukkende tumormicro-omgeving5.
Recente klinische onderzoeken zijn begonnen met het evalueren van CAR T-celtherapie voor pediatrische CNS-tumoren, met bewijs van concept en vroeg bewijs van T-celactiviteit in voorlopige rapporten 6,7,8. Hoewel de meeste initiële preklinische gegevens gericht waren op intraveneuze toediening van de CAR T-cellen, heeft recent preklinisch bewijs de superioriteit van locoregionale toediening in het CZS9,10 gesuggereerd, die ook met succes is gebruikt in verschillende klinische onderzoeken 6,7,8,11 . Preklinische studies tot nu toe die de locoregionale levering van CAR T-cellen in het CZS hebben opgenomen, hebben vertrouwd op een enkele intracraniale dosis CAR T-cellen diestereotactisch 9,10 worden afgeleverd. Klinische proeven bij mensen hebben echter herhaalde infusies van CAR T-cellen in het CZS 6,7,8,11 vereist, wat de noodzaak onderstreept om meerdere herhaalde infusies in preklinische ontwikkeling te evalueren. Het doel van deze procedure is om met succes seriële CAR T-celinfusies te testen met behulp van een katheter in orthotopische muizenmodellen van pediatrische hersentumoren. Het voordeel van deze techniek is het vermijden van meerdere chirurgische procedures om herhaalde intra-CZS-behandelingen te bieden. Canules zijn voornamelijk gebruikt voor microdialysebemonstering van neurotransmitters en de levering van neuroactieve stoffen in neurowetenschappen en gedragsonderzoek bij knaagdieren12, met beperkte rapporten over hun gebruik voor de levering van antikankertherapieën. Voortbouwend op de eerdere rapporten maakt dit protocol gebruik van een stereotactisch geplaatst inwonend canulesysteem om CAR T-cellen af te leveren in xenograft murine-modellen van CNS-tumoren. Het protocol kan worden gebruikt om aanvullende therapieën te testen in muizenmodellen van neurologische of neuro-oncologische aandoeningen, en kan nuttig zijn om nieuwe therapieën te testen waarbij het omzeilen van de bloed-hersenbarrière van cruciaal belang is voor de werkzaamheid.
CAR T-celtherapie heeft een revolutie teweeggebracht in de behandeling van hematologische kankers en toont veelbelovende waarde bij de behandeling van solide hersentumoren 6,7,8. Dit protocol is ontworpen om de preklinische evaluatie van locoregionale CAR T-celafgifte mogelijk te maken voor de behandeling van pediatrische CZS-tumoren. Het canulesysteem repliceert een Ommaya- of Rickham-reservoir, een intraventriculair kathetersysteem dat momenteel wordt gebruikt in lopende klinische onderzoeken naar CAR T-celtherapie in pediatrische CNS-tumoren 6,7,8, wat de relevantie en het translationele potentieel van deze methoden onderstreept. Dit systeem maakt de herhaalde levering van CAR T-cellen mogelijk die de bloed-hersenbarrière omzeilen, opnieuw vergelijkbaar met methoden die worden gebruikt in lopende klinische onderzoeken. Locoregionale toediening kan maximale werkzaamheid bieden in het CZS9 en kan ook het risico op systemische toxiciteiten geassocieerd met handel uit circulatie15 verminderen. Hoewel stereotactische toediening een enkele dosis in het CZS kan bieden, is het voordeel van dit systeem de mogelijkheid om meerdere herhaalde doses op een bepaalde locatie in het CZS te geven zonder dat er meerdere operaties nodig zijn. De beperkingen van deze procedure omvatten een vaste afleverlocatie zonder de mogelijkheid om van locatie te veranderen of aanpassingen aan te brengen zodra de canule op zijn plaats is, en de mogelijkheid van losraken van de canule.
Een cruciale stap in dit protocol is de implantatie van de vaste geleidingscanule op een D/V-coördinaat die rekening houdt met de projectie van de behandelingscanules. De behandelingscanule steekt uit buiten de punt van de geleidecanule en daarom moet ervoor worden gezorgd dat de plaatsing resulteert in de levering van CAR T-cellen aan het gebied van belang. Projectielengtes van de behandelingscanule kunnen worden aangepast en in de ervaring van de auteur is 0,5 mm een nuttige projectielengte. Deze lengte zorgt ervoor dat de therapeutica niet in de geleidecanule blijft bij het doseren, maar vereist ook geen significante aanpassing van de D / V-coördinaten voor de geleidecanule aan het gebied van belang. Een extra belangrijke stap in dit protocol is de tijd dat de behandelingscanule op zijn plaats blijft na CAR T-celinfusie. De behandelingscanule moet gedurende ten minste 1 minuut na het einde van de infusie op zijn plaats worden gehouden om lekken en het verlies van locoregionale toediening van CAR T-celtherapie te voorkomen.
Het oplossen van problemen met deze methode is eenvoudig, met de meeste complicaties die gepaard gaan met het verwijderen van de dummycanule of het inbrengen van de behandelingscanule in de vaste geleidecanule, waarschijnlijk als gevolg van gedroogd bloed aan de binnenkant van de geleidecanule. Dit kan eenvoudig worden opgelost door de dummycanule voorzichtig door de geleidecanule te laten gaan totdat er minder weerstand is en het puin is opgeruimd. De acrylhars kan af en toe loskomen van de schedel, wat resulteert in het verlies van het canulesysteem. Onze ervaring is dat dit over het algemeen beperkt is door het scoren van de schedel met een scalpel en het plaatsen van twee schroeven. Bovendien worden alle items uit de kooi verwijderd die per ongeluk kracht op de canule kunnen uitoefenen terwijl de muis beweegt, zoals bepaalde muisverrijkingshutten met kleine openingen.
Kortom, hier beschreven is een protocol voor het inbrengen van een canulesysteem in muizenmodellen van CZS-tumoren voor de herhaalde levering van CAR T-cellen. De plaatsing van canules kan worden aangepast aan meerdere locoregionale afleverlocaties, waardoor de effectiviteit van verschillende toedieningslocaties wordt getest. Bovendien kan dit systeem worden gebruikt voor aanvullende therapieën buiten CAR T-cellen om de werkzaamheid te evalueren bij het omzeilen van de bloed-hersenbarrière, en kan het ook nuttig zijn voor de evaluatie van therapeutica in muizenmodellen van niet-oncologische aandoeningen.
The authors have nothing to disclose.
Financiering voor dit werk werd verstrekt door de Matthew Larson Foundation, Grayson Saves Foundation, Hyundai Hope on Wheels Young Investigator Award, Kortney Rose Foundation, National Institutes of Health NCI K12 CA076931-19 en 1K08CA263179-01, en het Department of Defense W81XWH-21-1-0221.
18 G needles | BD | 511097 | 1 1/2 inch metal hub |
Acrylic resin liquid | Lang Dental | B1323 | |
Acrylic resin powder | Lang Dental | B1323 | |
Alcohol wipes | BD | 326895 | |
Centrifuge 5240 | Eppendorf | 5420000040 | Centrifuge |
Cotton tipped swabs | Puritan | 826-WC | Handle Width = 2.11 mm (0.083), Head Width = 1.27 mm (0.050), Handle Length = 147.62 mm (5.812), Overall Length = 152.4 mm (6), Head Length = 12.7 mm (0.500) |
Drill bit holder | P1 Technologies | DH-1 | Drill bit holder for D56-D70 |
Drill bit | P1 Technologies | D58 | 1.07 mm |
Dummy cannula | P1 Technologies | C315DCS-5/SPC | Configuration: Small cap; Length: Cut 5.00 mm below pedestal; Projection: 0.50 mm |
Flat tip screwdriver | P1 Technologies | SD-80 | Screwdriver |
Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | Forceps |
Guide cannula | P1 Technologies | C315GS-5/SPC | Configuration: 5.00 mm pedestal height; Length: Cut 5.00 mm below pedestal |
Hemostatic cotton pellets with racemic epinephrine | Pascal | 1151602 | |
MOXI Z Mini automated cell counter Kit | Moxi | MXZ001 | Cell counter |
NOD scid gamma (NSG) mice | Jackson Laboratory | 5557 | 6 to 12-week-old males and females |
Pasteur pipet | VWR | 14673-043 | |
PKG tubing | P1 Technologies | C313CT | Diameter: 0.58 mm x 1.27 mm |
Porcelain 12 well plate | Flinn Scientific | AP6064 | |
Povidone iodine | Medline | MDS093943 | |
Scalpel | World Precision Instrument | 50-822-457 | Disposable Scalpel, no.10, sterile, 10/box, Plastic Handle with 6" Ruler |
Screws | P1 Technologies | 0-80 X 3/32 | 2.4 mm |
Stereotaxic Frame | David Kopf Instruments | 940 | Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console |
Student fine scissors | Fine Science Tools | 91460-12 | Scissors |
Treatment cannula | P1 Technologies | C315IS-5/SPC | 33GA; Configuration: Standard internal; Length: Cut 5.00 mm below pedestal; Projection: 0.50 mm |
Treatment syringes | Hamilton | 87908 | 5 µL, Model 75 Cemented Needle Special (SN) Syringe, 75SN/22/0.5"/PT3 |
Vactrap XL | Foxx Life Sciences | 305-4401-FLS | Vacuum System |