Estabelecimento e Cultura de Organoides Mamários Derivados da Paciente
Summary
Um protocolo detalhado é fornecido aqui para estabelecer organoides mamários humanos a partir de ressecções de tumor de mama derivadas de pacientes ou tecido mamário normal. O protocolo fornece instruções passo a passo abrangentes para cultivar, congelar e descongelar organoides mamários derivados de pacientes humanos.
Abstract
O câncer de mama é uma doença complexa que tem sido classificada em vários subtipos histológicos e moleculares. Os organoides de tumor de mama derivados de pacientes desenvolvidos em nosso laboratório consistem em uma mistura de múltiplas populações de células derivadas de tumores, e assim representam uma melhor aproximação da diversidade e do meio celular tumoral do que as linhagens de células cancerosas 2D estabelecidas. Os organoides servem como um modelo ideal in vitro , permitindo interações célula-matriz extracelular, conhecidas por desempenhar um papel importante nas interações célula-célula e na progressão do câncer. Os organoides derivados do paciente também têm vantagens sobre os modelos de camundongos, pois são de origem humana. Além disso, eles demonstraram recapitular a heterogeneidade genômica, transcriptômica e metabólica dos tumores dos pacientes; Assim, são capazes de representar a complexidade tumoral, bem como a diversidade de pacientes. Como resultado, eles estão prontos para fornecer insights mais precisos sobre a descoberta e validação de alvos e ensaios de sensibilidade a medicamentos. Neste protocolo, fornecemos uma demonstração detalhada de como organoides mamários derivados de pacientes são estabelecidos a partir de tumores de mama ressecados (organoides de câncer) ou tecido mamário derivado de mamoplastia redutiva (organoides normais). Isso é seguido por um relato abrangente de cultura de organoides 3D, expansão, passagem, congelamento, bem como descongelamento de culturas de organoides mamários derivadas de pacientes.
Introduction
O câncer de mama (CM) é a neoplasia maligna mais comum no sexo feminino, estimando-se que 287.850 novos casos sejam diagnosticados nos Estados Unidos em 20221. Apesar dos recentes avanços na detecção precoce com rastreios anuais, terapias-alvo e melhor compreensão da predisposição genética, ela prevalece como a segunda principal causa de mortes por câncer em mulheres nos Estados Unidos, com >40.000 mortes atribuídas ao câncer de mama anualmente1. Atualmente, o câncer de mama é classificado em múltiplos subtipos, com base na avaliação histopatológica e molecular do tumor primário. Uma melhor estratificação de subtipos melhorou os resultados dos pacientes com opções de tratamento específicas para subtipos2. Por exemplo, a identificação do HER2 como um proto-oncogene3 levou ao desenvolvimento do trastuzumabe, o que tornou esse subtipo altamente agressivo manejável na maioria dos pacientes4. Pesquisas adicionais sobre a genética e a transcriptômica dessa complexa doença de maneira específica do paciente ajudarão a desenvolver e prever melhores regimes de tratamento personalizados específicos para o paciente 2,5. Os organoides derivados do paciente (DOPs) são um novo modelo promissor para obter informações sobre o câncer em nível molecular, identificando novos alvos ou biomarcadores e desenhando novas estratégias de tratamento 6,7,8.
As DOPs são estruturas multicelulares, tridimensionais (3D), derivadas de amostras de tecido primário recém-ressecadas 8,9. Eles são cultivados tridimensionalmente por estarem embutidos em uma matriz de hidrogel, tipicamente composta por uma combinação de proteínas da matriz extracelular (MEC) e, portanto, podem ser usados para estudar interações célula-MEC tumoral. As DOPs representam a diversidade de pacientes e recapitulam a heterogeneidade celular e as características genéticas do tumor10,11,12. Por serem modelos in vitro, permitem a manipulação genética e a triagem de fármacos de alto rendimento13,14,15. Além disso, as DOPs podem ser utilizadas de forma plausível para avaliar a sensibilidade medicamentosa e as estratégias de tratamento do paciente em paralelo à clínica e ajudar a prever os resultados dos pacientes16,17,18. Além da quimioterapia, alguns modelos organoides também têm sido utilizados para examinar as respostas individuais dos pacientes à quimiorradiação19,20. Dada a promissora aplicabilidade das DOPs para pesquisa e uso clínico, o Instituto Nacional do Câncer iniciou um consórcio internacional, The Human Cancer Models Initiative (HCMI)21, para gerar e fornecer esses novos modelos de câncer derivados de tumores. Muitos dos modelos organoides de vários tipos de câncer desenvolvidos através do HCMI estão disponíveis através da American Type Culture Collection (ATCC)22.
Os organoides mamários normais têm se mostrado compostos por diferentes populações de células epiteliais presentes na glândula mamária 11,23 e, portanto, servem como ótimos modelos para o estudo de processos biológicos básicos, para a análise de mutações condutoras causadoras da tumorigênese e para estudos de linhagens de células cancerígenasde origem 6,15 . Modelos organoides de tumores de mama têm sido utilizados para identificar novos alvos que encorajam as perspectivas para o desenvolvimento de novas terapias, particularmente para tumores resistentes24,25,26. Guillen e col. mostraram que os organoides são modelos poderosos para a medicina de precisão, que podem ser aproveitados para avaliar respostas a drogas e direcionar decisões terapêuticas paralelamente28. Além disso, o desenvolvimento de novos métodos de co-cultura para cultivo de DOPs com várias células imunes27,28,29, fibroblastos30,31 e micróbios32,33 representa uma oportunidade para estudar o impacto do microambiente tumoral na progressão do câncer. Enquanto muitos desses métodos de co-cultura estão sendo ativamente estabelecidos para DOPs derivadas de tumores pancreáticos ou colorretais, métodos similares estabelecidos de co-cultura para DOPs de mama só foram relatados para células natural killer34 e fibroblastos35.
O primeiro biobanco de >100 organoides derivados de pacientes, representando diferentes subtipos de câncer de mama, foi desenvolvido pelo grupo de Hans Clevers36,37. Como parte desse esforço, o grupo Clevers também desenvolveu o primeiro meio de cultura complexo para o crescimento organoide mamário, que atualmente é amplamente utilizado36. Um estudo de seguimento forneceu um relato abrangente do estabelecimento e cultura de DOPs mamárias e xenoenxertos organoides derivados da paciente (PDOXs)38. O laboratório de Welm desenvolveu uma grande coleção de modelos BC PDX e PDxOs que são cultivados em um meio de crescimento comparativamente mais simples contendo soro fetal bovino (SFB) e menos fatores de crescimento 39,40. Desenvolvemos e caracterizamos independentemente uma grande variedade de modelos organoides de câncer de mama derivados de pacientes virgens11 e participamos do desenvolvimento de modelos de DOP de BC como parte da iniciativa HCMI21. Aqui, pretendemos fornecer um guia prático detalhando a metodologia empregada por nós na geração de sistemas de modelos organoides mamários derivados de pacientes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nosso laboratório tem empregado com sucesso os protocolos acima para estabelecer organoides a partir de ressecções ou raspagens tumorais virgens. Também utilizamos este protocolo para desenvolver organoides normais a partir de tecido mamário obtido por mamoplastias redutoras ou de tecido mamário normal adjacente ou distal de pacientes com câncer. Cerca de 30%-40% dos tumores primários ressecados resultaram em culturas de organoides tumorais bem-sucedidas a longo prazo (>passagem 8). As linhagens organoid…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório Spector pelas discussões críticas ao longo deste trabalho. Agradecemos a Norman Sachs e Hans Clevers (Instituto Hubrecht, Holanda) por inicialmente nos fornecerem seu protocolo de cultura de organoides. Agradecemos aos Recursos Compartilhados de Histologia e Microscopia do CSHL Cancer Center pelos serviços e conhecimento técnico (NCI 2P3OCA45508). Agradecemos ao Dr. Qing Gao pela assistência na preparação da amostra histológica. Somos gratos pelo apoio da Dra. Karen Kostroff (Northwell Health) por fornecer amostras de tumores de pacientes. Também agradecemos os esforços da equipe do Northwell Health Biobanking para a aquisição de amostras e agradecemos aos pacientes e suas famílias pela doação de tecidos para pesquisa. Esta pesquisa foi apoiada por CSHL/Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.) e Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson e D.L.S).
Materials
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-1068 | |
| 175 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-308 | |
| 37 °C bead bath | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 50 mL conical tubes | VWR | 525-1077 | |
| 50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) | Millipore Sigma | SCGP00525 | SCGP00525 |
| 500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter | Nalgene | 566-0020 | |
| 6-well culture plates | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-304 | |
| 96-well opaque plates | Corning | 353296 | For CTG assay |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 12587010 | |
| BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader | Fisher Scientific (Agilent) | For dual luciferase assay and CTG assay | |
| BSA fraction V (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | |
| Cell Titer-Glo (CTG) Reagent | Promega | G9683 | luminescent cell viability assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Type IV |
| Cryolabels | Amazon | DTCR-1000 | Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5" |
| Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
| Epidermal growth factor (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| FGF-10 (human) | Peprotech | 100-26 | |
| FGF-7/KGF (human) | Peprotech | 100-19 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | For TOPFlash Assay |
| HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells | R&D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells |
| HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
| Heregulinβ-1 (human) | Peprotech | 100-03 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix |
| Mr. Frosty Cell Freezing Container | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
| Mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-418 | |
| N-acetyl-l-cysteine | Millipore Sigma | A9165 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636 | |
| Noggin (human) | Peprotech | 120-10C | |
| P1000, P200, P10 pipettes with tips | |||
| p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
| Parafilm | transparent film | ||
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Plasmid1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
| Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
| Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
| pluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-01 | |
| Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 | cell freezing medium |
| Red Blood Cell lysis buffer | Millipore Sigma | 11814389001 | |
| R-spondin conditioned media | In-house or commercial from Peprotech | 120-38 | |
| Scalpel (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
| Shaker (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
| TGF-β receptor inhibitor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Life Technologies | 12605028 | cell dissociation reagent |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Millipore Sigma | 6365779001 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |
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