Identification des gènes impliqués dans le développement stomatique par notation du phénotype épidermique
Summary
Cet article décrit deux méthodes de phénotypage sans l’utilisation de peelings épidermiques pour caractériser les gènes contrôlant le développement stomatique. La première méthode montre comment analyser un phénotype stomatique à l’aide d’un épiderme végétal coloré au bleu de toluidine O. La deuxième méthode décrit comment identifier les ligands stomatiques et surveiller leurs activités biologiques.
Abstract
Les stomates sont de petits pores à la surface des plantes terrestres qui sont impliqués dans les échanges gazeux et la libération de vapeur d’eau, et leur fonction est essentielle à la productivité et à la survie des plantes. En tant que tel, la compréhension des mécanismes par lesquels les stomates se développent et se modèlent a une valeur agronomique énorme. Cet article décrit deux méthodes phénotypiques utilisant des cotylédons d’Arabidopsis qui peuvent être utilisées pour caractériser les gènes contrôlant le développement stomatique et la structuration. Les procédures d’analyse des phénotypes stomatiques à l’aide de cotylédons colorés au bleu de toluidine sont présentées en premier. Cette méthode est rapide et fiable et ne nécessite pas l’utilisation de peelings épidermiques, qui sont largement utilisés pour les analyses phénotypiques mais nécessitent une formation spécialisée. En raison de la présence de multiples résidus de cystéine, l’identification et la génération de peptides EPF bioactifs qui jouent un rôle dans le développement stomatique ont été difficiles. Ainsi, présenté en second est une procédure utilisée pour identifier les ligands stomatiques et surveiller leur activité biologique par des essais biologiques. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle produit des données reproductibles relativement facilement tout en réduisant la quantité de solution peptidique et le temps nécessaire pour caractériser le rôle des peptides dans le contrôle de la structuration et du développement stomatiques. Dans l’ensemble, ces protocoles bien conçus améliorent l’efficacité de l’étude des régulateurs stomatiques potentiels, y compris les peptides sécrétoires riches en cystéine, qui nécessitent des structures très complexes pour leur activité.
Introduction
Une structuration et une différenciation appropriées des stomates des plantes sont essentielles à leur fonction dans deux processus biologiques fondamentaux, la photosynthèse et la transpiration, et sont renforcées par les voies de signalisation des peptides EPF. Chez Arabidopsis, trois peptides riches en cystéine sécrétés, EPF1, EPF2 et STOMAGEN/EPFL9, contrôlent différents aspects du développement stomatique et sont perçus par les composants récepteurs de surface cellulaire, y compris les kinases des récepteurs de la famille ERECTA (ER, ERL1 et ERL2), les SERK et TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Cette reconnaissance conduit alors à la régulation négative des facteurs de transcription qui favorisent la différenciation stomatique par un processus dépendant du MAPK11. La découverte de ces gènes stomatiques centraux est principalement réalisée par le criblage phénotypique de mutants présentant des défauts épidermiques. Cet article présente des méthodes de phénotypage relativement simples et efficaces pour visualiser les stomates et autres cellules épidermiques, qui sont nécessaires pour identifier et caractériser les gènes potentiels contrôlant la structuration et la différenciation stomatiques.
L’observation des détails de l’épiderme de la plante a généralement été réalisée en utilisant des peelings épidermiques avec ou sans coloration avec un colorant tel que le bleu de toluidine O (TBO) ou la safranine12,13,14. Cependant, le principal défi de ces méthodes est qu’elles nécessitent une formation spécialisée pour peler l’épiderme foliaire sans déchirer les tissus et pour observer et analyser attentivement les données de motifs tout en évitant les images prises à partir de différentes parties de la feuille. Les traitements chimiques visant à nettoyer les échantillons de tissus avec des réactifs tels que les solutions d’élimination à base d’hydrate de chloral ont également été largement utilisés pour diverses gammes de matières biologiques 8,15; Ces traitements génèrent beaucoup d’informations phénotypiques en fournissant des images de haute qualité, mais nécessitent également l’utilisation de produits chimiques dangereux (par exemple, le formaldéhyde, l’hydrate de chloral). Cet article présente d’abord une méthode de phénotypage relativement simple et pratique qui produit des images suffisantes pour l’analyse quantitative, mais ne nécessite pas l’utilisation de produits chimiques dangereux et de pelures de feuilles épidermiques pour la préparation de l’échantillon. Un épiderme de cotylédon coloré au TBO est également idéal pour l’étude du développement stomatique car l’absence de trichomes et le gradient de développement plus petit chez les cotylédons permettent une interprétation simple et traitable des phénotypes épidermiques.
Les peptides EPF stomatiques appartiennent au groupe des peptides riches en cystéine spécifiques aux plantes qui ont des tailles matures relativement grandes et des liaisons disulfures intramoléculaires entre les résidus de cystéine conservés. Un repliement conformationnel correct est essentiel pour leur fonction biologique, mais les peptides riches en cystéine, qui sont produits par synthèse chimique ou par un système de recombinaison hétérologue, peuvent être inactifs et sont un mélange de peptides correctement repliés et dépliés 3,7,16. Ainsi, le criblage des peptides bioactifs qui jouent un rôle dans le contrôle du développement stomatique a été une tâche très difficile. Ce manuscrit décrit en outre un essai biologique pour une meilleure identification et caractérisation des peptides stomatiques bioactifs. Dans cette méthode, les plantules d’Arabidopsis sont cultivées dans une plaque multipuits contenant des milieux avec et sans peptides potentiels pendant 6-7 jours. Ensuite, l’épiderme cotylédon est visualisé à l’aide d’un microscope confocal. En général, pour visualiser clairement l’activité biologique des peptides potentiels dans le développement stomatique, les génotypes qui produisent plus ou moins de cellules de lignée stomatiques, tels que le mutant epf2, qui produit plus de cellules épidermiques, et la lignée STOMAGEN-ami, qui confère une densité cellulaire épidermique réduite 2,4,5, sont utilisés en plus du contrôle Arabidopsis de type sauvage (Col-0) pour les essais biologiques.
Dans l’ensemble, les deux protocoles présentés ici peuvent être utilisés pour l’évaluation rapide et efficace de divers phénotypes épidermiques et pour le criblage de petits peptides et hormones qui jouent un rôle dans le contrôle de la structuration et du développement stomatiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les deux méthodes d’analyse phénotypique pour identifier et caractériser les gènes contrôlant la structuration et la différenciation stomatiques présentées ici sont des tests pratiques et fiables puisque les protocoles ne nécessitent pas l’utilisation de peelings épidermiques et d’équipement spécialisé (qui prennent beaucoup de temps et nécessitent une formation spéciale pour la préparation des échantillons) mais produisent des images de haute qualité pour l’analyse quantitative des phénotypes …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée dans le cadre du Programme de découverte du Conseil de recherches en ressources naturelles et en génie du Canada (CRSNG) et de l’Université Concordia. K.B. est soutenu par la National Overseas Scholarship de l’Inde.
Materials
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
References
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
- Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
- Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
- Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
- Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
- Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
- Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
- Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
- Nadeau, J. A., Sack, F. D. Control of stomatal distribution on the Arabidopsis leaf surface. Science. 296 (5573), 1697-1700 (2002).
- Meng, X., et al. Differential function of Arabidopsis SERK family receptor-like kinases in stomatal patterning. Current Biology. 25 (18), 2361-2372 (2015).
- Lampard, G. R., Macalister, C. A., Bergmann, D. C. Arabidopsis stomatal initiation is controlled by MAPK-mediated regulation of the bHLH SPEECHLESS. Science. 322 (5904), 1113-1116 (2008).
- Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. The Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
- Theunissen, J. D. An improved method for studying grass leaf epidermis. Stain Technology. 64 (5), 239-242 (1989).
- Venkata, B. P., et al. crw1–A novel maize mutant highly susceptible to foliar damage by the western corn rootworm beetle. PLoS One. 8 (8), 71296 (2013).
- Tucker, M. R., et al. Somatic small RNA pathways promote the mitotic events of megagametogenesis during female reproductive development in Arabidopsis. Development. 139 (8), 1399-1404 (2012).
- Ohki, S., Takeuchi, M., Mori, M. The NMR structure of stomagen reveals the basis of stomatal density regulation by plant peptide hormones. Nature Communications. 2, 512 (2011).
- Jangra, R., et al. Duplicated antagonistic EPF peptides optimize grass stomatal initiation. Development. 148 (16), (2021).
- Zhao, C., Craig, J. C., Petzold, H. E., Dickerman, A. W., Beers, E. P. The xylem and phloem transcriptomes from secondary tissues of the Arabidopsis root-hypocotyl. Plant Physiology. 138 (2), 803-818 (2005).
- Uchida, N., et al. Regulation of inflorescence architecture by intertissue layer ligand-receptor communication between endodermis and phloem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (16), 6337-6342 (2012).
- Tameshige, T., et al. A secreted peptide and its receptors shape the auxin response pattern and leaf margin morphogenesis. Current Biology. 26 (18), 2478-2485 (2016).
- Abrash, E. B., Davies, K. A., Bergmann, D. C. Generation of signaling specificity in Arabidopsis by spatially restricted buffering of ligand-receptor interactions. The Plant Cell. 23 (8), 2864-2879 (2011).
- Uchida, N., Tasaka, M. Regulation of plant vascular stem cells by endodermis-derived EPFL-family peptide hormones and phloem-expressed ERECTA-family receptor kinases. Journal of Experimental Botany. 64 (17), 5335-5343 (2013).
- Kosentka, P. Z., Overholt, A., Maradiaga, R., Mitoubsi, O., Shpak, E. D. EPFL Signals in the boundary region of the SAM restrict its size and promote leaf initiation. Plant Physiology. 179 (1), 265-279 (2019).
