Identifizierung der Gene, die an der Entwicklung der Stomata beteiligt sind, mittels epidermalem Phänotyp-Scoring
Summary
In dieser Arbeit werden zwei Phänotypisierungsmethoden ohne die Verwendung von epidermalen Peelings beschrieben, um die Gene zu charakterisieren, die die Entwicklung der Stomata steuern. Die erste Methode zeigt, wie ein stomataler Phänotyp unter Verwendung einer Toluidinblau-O-gefärbten Pflanzenepidermis analysiert werden kann. Die zweite Methode beschreibt, wie man stomatale Liganden identifiziert und ihre biologischen Aktivitäten überwacht.
Abstract
Stomata sind kleine Poren auf der Oberfläche von Landpflanzen, die am Gasaustausch und der Freisetzung von Wasserdampf beteiligt sind, und ihre Funktion ist entscheidend für die Produktivität und das Überleben von Pflanzen. Daher hat das Verständnis der Mechanismen, durch die sich Stomata entwickeln und mustern, einen enormen agronomischen Wert. In dieser Arbeit werden zwei phänotypische Methoden unter Verwendung von Arabidopsis-Keimblättern beschrieben, die zur Charakterisierung der Gene verwendet werden können, die die Entwicklung und Musterung der Stomata steuern. Zunächst werden Verfahren zur Analyse der stomatalen Phänotypen unter Verwendung von Toluidinblau O-gefärbten Keimblättern vorgestellt. Diese Methode ist schnell und zuverlässig und erfordert keine Verwendung von epidermalen Peelings, die häufig für phänotypische Analysen verwendet werden, aber eine spezielle Schulung erfordern. Aufgrund des Vorhandenseins mehrerer Cysteinreste war die Identifizierung und Erzeugung von bioaktiven EPF-Peptiden, die eine Rolle bei der Entwicklung der Stomata spielen, eine Herausforderung. Als zweites wird ein Verfahren vorgestellt, das zur Identifizierung von stomatalen Liganden und zur Überwachung ihrer biologischen Aktivität durch Bioassays verwendet wird. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie relativ einfach reproduzierbare Daten liefert und gleichzeitig die Menge an Peptidlösung und die Zeit reduziert, die erforderlich ist, um die Rolle der Peptide bei der Kontrolle der stomatalen Musterung und Entwicklung zu charakterisieren. Insgesamt verbessern diese gut konzipierten Protokolle die Effizienz bei der Untersuchung der potenziellen stomatalen Regulatoren, einschließlich Cystein-reicher sekretorischer Peptide, die für ihre Aktivität hochkomplexe Strukturen benötigen.
Introduction
Die richtige Strukturierung und Differenzierung der pflanzlichen Stomata ist entscheidend für ihre Funktion in zwei grundlegenden biologischen Prozessen, Photosynthese und Transpiration, und wird durch EPF-Peptid-Signalwege verstärkt. In Arabidopsis kontrollieren drei sezernierte Cystein-reiche Peptide, EPF1, EPF2 und STOMAGEN/EPFL9, verschiedene Aspekte der stomatalen Entwicklung und werden von Zelloberflächenrezeptorkomponenten wahrgenommen, einschließlich Rezeptorkinasen der ERECTA-Familie (ER, ERL1 und ERL2), SERKs und TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Diese Erkennung führt dann zur Herunterregulierung der Transkriptionsfaktoren, die die stomatale Differenzierung durch einen MAPK-abhängigen Prozess fördern11. Die Entdeckung dieser stomatalen Kerngene wird in erster Linie durch das phänotypische Screening von Mutanten mit epidermalen Defekten erreicht. In dieser Arbeit werden relativ einfache und effiziente Phänotypisierungsmethoden zur Visualisierung der Stomata und anderer Epidermiszellen vorgestellt, die zur Identifizierung und Charakterisierung der potenziellen Gene erforderlich sind, die die stomatale Musterung und Differenzierung steuern.
Die Beobachtung der Details der Pflanzenepidermis wurde typischerweise durch die Verwendung von Epidermisschalen mit oder ohne Färbung mit einem Farbstoff wie Toluidinblau O (TBO) oder Safranin12,13,14 erreicht. Die größte Herausforderung dieser Methoden besteht jedoch darin, dass sie ein spezielles Training erfordern, um die Blattepidermis zu schälen, ohne das Gewebe zu zerreißen, und um die Musterdaten sorgfältig zu beobachten und zu analysieren, während die Bilder vermieden werden, die von verschiedenen Teilen des Blattes aufgenommen wurden. Chemische Behandlungen zur Reinigung der Gewebeproben mit Reagenzien wie Chloralhydrat-basierten Reinigungslösungen wurden auch häufig für eine Vielzahl von biologischen Materialien verwendet 8,15; Diese Behandlungen erzeugen zwar viele phänotypische Informationen, indem sie qualitativ hochwertige Bilder liefern, erfordern aber auch den Einsatz gefährlicher Chemikalien (z. B. Formaldehyd, Chloralhydrat). In diesem Artikel wird zunächst eine relativ einfache und bequeme Phänotypisierungsmethode vorgestellt, die Bilder erzeugt, die für eine quantitative Analyse ausreichen, aber nicht die Verwendung gefährlicher Chemikalien und epidermaler Blattschalen für die Probenvorbereitung erfordert. Eine TBO-gefärbte Keimblattepidermis ist auch ideal für die Untersuchung der stomatalen Entwicklung, da das Fehlen von Trichomen und der geringere Entwicklungsgradient in Keimblättern eine einfache und handhabbare Interpretation der epidermalen Phänotypen ermöglichen.
Stomatale EPF-Peptide gehören zur Gruppe der pflanzenspezifischen, cysteinreichen Peptide, die relativ große reife Größen und intramolekulare Disulfidbindungen zwischen konservierten Cysteinresten aufweisen. Die korrekte Konformationsfaltung ist entscheidend für ihre biologische Funktion, aber Cystein-reiche Peptide, die entweder durch chemische Synthese oder ein heterologes Rekombinationssystem hergestellt werden, können inaktiv sein und sind eine Mischung aus richtig gefalteten und ungefalteten Peptiden 3,7,16. Daher war das Screening von bioaktiven Peptiden, die eine Rolle bei der Kontrolle der stomatalen Entwicklung spielen, eine sehr herausfordernde Aufgabe. Dieses Manuskript beschreibt zusätzlich einen Bioassay zur besseren Identifizierung und Charakterisierung von bioaktiven stomatalen Peptiden. Bei dieser Methode werden Arabidopsis-Sämlinge 6-7 Tage lang in einer Multi-Well-Platte gezüchtet, die Medien mit und ohne potenzielle Peptide enthält. Dann wird die Keimblattepidermis mit einem konfokalen Mikroskop sichtbar gemacht. Um die biologische Aktivität potenzieller Peptide in der Entwicklung der Stomata deutlich sichtbar zu machen, werden im Allgemeinen zusätzlich zur Wildtyp-Arabidopsis-Kontrolle (Col-0) zusätzlich zur Wildtyp-Arabidopsis-Kontrolle (Col-0) die Wildtyp-Arabidopsis-Kontrolle (Col-0) verwendet, die mehr Epidermiszellen produziert.
Insgesamt können die beiden hier vorgestellten Protokolle für die schnelle und effiziente Beurteilung verschiedener epidermaler Phänotypen und für das Screening kleiner Peptide und Hormone verwendet werden, die eine Rolle bei der Kontrolle der stomatalen Musterung und Entwicklung spielen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die beiden hier vorgestellten phänotypischen Analysemethoden zur Identifizierung und Charakterisierung der Gene, die die stomatale Musterung und Differenzierung steuern, sind praktische und zuverlässige Assays, da die Protokolle nicht die Verwendung von epidermalen Peelings und speziellen Geräten erfordern (die zeitaufwändig sind und eine spezielle Schulung für die Probenvorbereitung erfordern), aber qualitativ hochwertige Bilder für die quantitative Analyse von epidermalen Phänotypen erzeugen.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch das Discovery-Programm des Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) und der Concordia University finanziert. K.B. wird durch das National Overseas Scholarship aus Indien unterstützt.
Materials
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
References
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