एपिडर्मल फेनोटाइप स्कोरिंग के माध्यम से स्टोमेटा विकास में शामिल जीन की पहचान
Summary
यह पेपर स्टोमेटा विकास को नियंत्रित करने वाले जीन को चिह्नित करने के लिए एपिडर्मल छिलके के उपयोग के बिना दो फेनोटाइपिंग विधियों का वर्णन करता है। पहली विधि दर्शाती है कि टोल्यूडाइन ब्लू ओ-सना हुआ पौधे एपिडर्मिस का उपयोग करके स्टोमेटा फेनोटाइप का विश्लेषण कैसे किया जाए। दूसरी विधि बताती है कि स्टोमेटा लिगेंड की पहचान कैसे करें और उनकी जैविक गतिविधियों की निगरानी करें।
Abstract
स्टोमेटा भूमि पौधों की सतह पर छोटे छिद्र हैं जो गैस विनिमय और जल वाष्प रिलीज में शामिल हैं, और उनका कार्य पौधे की उत्पादकता और अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है। जैसे, उन तंत्रों को समझना जिनके द्वारा स्टोमेटा विकसित होता है और पैटर्न का जबरदस्त कृषि संबंधी मूल्य है। यह पेपर एराबिडोप्सिस कोटिलेडोन का उपयोग करके दो फेनोटाइपिक तरीकों का वर्णन करता है जिनका उपयोग स्टोमेटा विकास और पैटर्निंग को नियंत्रित करने वाले जीन को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है। पहले प्रस्तुत टोलुइडिन ब्लू ओ-सना हुआ कोटिलेडॉन का उपयोग करके स्टोमेटा फेनोटाइप का विश्लेषण करने के लिए प्रक्रियाएं हैं। यह विधि तेज और विश्वसनीय है और एपिडर्मल छिलके के उपयोग की आवश्यकता नहीं है, जो व्यापक रूप से फेनोटाइपिक विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाते हैं लेकिन विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। कई सिस्टीन अवशेषों की उपस्थिति के कारण, बायोएक्टिव ईपीएफ पेप्टाइड्स की पहचान और उत्पादन जो स्टोमेटा विकास में भूमिका निभाते हैं, चुनौतीपूर्ण रहे हैं। इस प्रकार, प्रस्तुत दूसरा एक प्रक्रिया है जिसका उपयोग स्टोमेटा लिगेंड की पहचान करने और बायोएसेस द्वारा उनकी जैविक गतिविधि की निगरानी के लिए किया जाता है। इस विधि का मुख्य लाभ यह है कि यह पेप्टाइड समाधान की मात्रा को कम करते हुए अपेक्षाकृत आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा का उत्पादन करता है और स्टोमेटा पैटर्निंग और विकास को नियंत्रित करने में पेप्टाइड्स की भूमिका को चिह्नित करने के लिए आवश्यक समय है। कुल मिलाकर, ये अच्छी तरह से डिज़ाइन किए गए प्रोटोकॉल सिस्टीन युक्त स्रावी पेप्टाइड्स सहित संभावित स्टोमेटा नियामकों का अध्ययन करने की दक्षता को बढ़ाते हैं, जिन्हें उनकी गतिविधि के लिए अत्यधिक जटिल संरचनाओं की आवश्यकता होती है।
Introduction
पौधे के स्टोमेटा का उचित पैटर्निंग और भेदभाव दो मौलिक जैविक प्रक्रियाओं, प्रकाश संश्लेषण और वाष्पोत्सर्जन में उनके कार्य के लिए महत्वपूर्ण हैं, और ईपीएफ पेप्टाइड सिग्नलिंग मार्गों द्वारा लागू किए जाते हैं। एराबिडोप्सिस में, तीन स्रावित सिस्टीन युक्त पेप्टाइड्स, ईपीएफ 1, ईपीएफ 2, और स्टोमाजेन / ईपीएफएल 9, स्टोमेटा विकास के विभिन्न पहलुओं को नियंत्रित करते हैं और सेल-सतह रिसेप्टर घटकों द्वारा माना जाता है, जिसमें इरेक्टा-परिवार रिसेप्टर किनेसेस (ईआर, ईआरएल 1, और ईआरएल 2), एसईआरसी और टीएमएम 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 शामिल हैं। . यह मान्यता तब प्रतिलेखन कारकों के डाउनरेग्यूलेशन की ओर ले जाती है जो एक एमएपी-निर्भर प्रक्रिया11 द्वारा स्टोमेटा भेदभाव को बढ़ावा देते हैं। इन कोर स्टोमेटा जीन की खोज मुख्य रूप से एपिडर्मल दोषों का प्रदर्शन करने वाले उत्परिवर्ती की फेनोटाइपिक स्क्रीनिंग द्वारा प्राप्त की जाती है। यह पेपर स्टोमेटा और अन्य एपिडर्मल कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए अपेक्षाकृत सरल और कुशल फेनोटाइपिंग विधियों को प्रस्तुत करता है, जो स्टोमेटा पैटर्निंग और भेदभाव को नियंत्रित करने वाले संभावित जीन की पहचान और विशेषता के लिए आवश्यक हैं।
पौधे एपिडर्मिस के विवरण का अवलोकन आमतौर पर टोलुइडिन ब्लू ओ (टीबीओ) या सैफ्रानिन12,13,14 जैसे डाई के साथ या बिना धुंधला किए एपिडर्मल छिलके का उपयोग करके प्राप्त किया गया है। हालांकि, इन विधियों की मुख्य चुनौती यह है कि उन्हें ऊतकों को फाड़े बिना पत्ती एपिडर्मिस को छीलने के लिए विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है और पत्ती के विभिन्न हिस्सों से ली गई छवियों से बचते हुए पैटर्निंग डेटा का सावधानीपूर्वक निरीक्षण और विश्लेषण किया जाता है। क्लोरल हाइड्रेट-आधारित समाशोधन समाधान जैसे अभिकर्मकों के साथ ऊतक के नमूनों को साफ करने के लिए रासायनिक उपचार भी जैविक सामग्री की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया गया है 8,15; ये उपचार उच्च गुणवत्ता वाली छवियां प्रदान करके फेनोटाइपिक जानकारी का एक बड़ा सौदा उत्पन्न करते हैं, लेकिन खतरनाक रसायनों (जैसे, फॉर्मलाडेहाइड, क्लोरल हाइड्रेट) के उपयोग की भी आवश्यकता होती है। यह पेपर पहले एक अपेक्षाकृत आसान और सुविधाजनक फेनोटाइपिंग विधि प्रस्तुत करता है जो मात्रात्मक विश्लेषण के लिए पर्याप्त छवियों का उत्पादन करता है लेकिन नमूना तैयार करने के लिए खतरनाक रसायनों और एपिडर्मल पत्ती के छिलके के उपयोग की आवश्यकता नहीं होती है। एक टीबीओ-सना हुआ कोटिलेडॉन एपिडर्मिस भी स्टोमेटा विकास के अध्ययन के लिए आदर्श है क्योंकि ट्राइकोम की कमी और कोटिलेडोन में छोटे विकास ढाल एपिडर्मल फेनोटाइप की सरल और वापस लेने योग्य व्याख्या की अनुमति देते हैं।
स्टोमेटा ईपीएफ पेप्टाइड्स पौधे-विशिष्ट, सिस्टीन-समृद्ध पेप्टाइड्स के समूह से संबंधित हैं जिनमें संरक्षित सिस्टीन अवशेषों के बीच अपेक्षाकृत बड़े परिपक्व आकार और इंट्रामोलेक्यूलर डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड होते हैं। सही विरूपण तह उनके जैविक कार्य के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन सिस्टीन युक्त पेप्टाइड्स, जो या तो रासायनिक संश्लेषण या हेटरोलॉगस पुनर्संयोजन प्रणाली द्वारा निर्मित होते हैं, निष्क्रिय हो सकते हैं और ठीक से मुड़े हुए और अनफोल्डेड पेप्टाइड्स 3,7,16 दोनों का मिश्रण हैं। इस प्रकार, बायोएक्टिव पेप्टाइड्स की स्क्रीनिंग जो स्टोमेटा विकास को नियंत्रित करने में भूमिका निभाती है, एक बहुत ही चुनौतीपूर्ण कार्य रहा है। यह पांडुलिपि बायोएक्टिव स्टोमेटा पेप्टाइड्स की बेहतर पहचान और लक्षण वर्णन के लिए एक बायोसेसे का भी वर्णन करती है। इस विधि में, एराबिडोप्सिस रोपाई को 6-7 दिनों के लिए संभावित पेप्टाइड्स के साथ और बिना मीडिया युक्त एक बहु-अच्छी प्लेट में उगाया जाता है। फिर, कोटिलेडॉन एपिडर्मिस को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कल्पना की जाती है। सामान्य तौर पर, स्टोमेटा विकास में संभावित पेप्टाइड्स की जैविक गतिविधि को स्पष्ट रूप से देखने के लिए, जीनोटाइप जो अधिक और / या कम स्टोमेटा वंश कोशिकाओं का उत्पादन करते हैं, जैसे कि ईपीएफ 2 उत्परिवर्ती, जो अधिक एपिडर्मल कोशिकाओं का उत्पादन करता है, और स्टोमाजेन-एमी लाइन, जो कम एपिडर्मल सेल घनत्व 2,4,5 प्रदान करता है, का उपयोग बायोसेस के लिए जंगली-प्रकार एराबिडोप्सिस नियंत्रण (कोल -0) के अलावा किया जाता है।
कुल मिलाकर, यहां प्रस्तुत दो प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न एपिडर्मल फेनोटाइप्स के त्वरित और कुशल मूल्यांकन के लिए और छोटे पेप्टाइड्स और हार्मोन की स्क्रीनिंग के लिए किया जा सकता है जिनकी स्टोमेटा पैटर्निंग और विकास को नियंत्रित करने में भूमिका है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां प्रस्तुत स्टोमेटा पैटर्निंग और भेदभाव को नियंत्रित करने वाले जीन की पहचान और विशेषता के लिए दो फेनोटाइपिक विश्लेषण विधियां सुविधाजनक और विश्वसनीय परख हैं क्योंकि प्रोटोकॉल को एपिडर्मल छिलके औ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को प्राकृतिक संसाधन और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद कनाडा (एनएसईआरसी) डिस्कवरी कार्यक्रम और कॉनकॉर्डिया विश्वविद्यालय के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था। के.बी. को भारत से राष्ट्रीय प्रवासी छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित किया जाता है।
Materials
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
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