Identificazione dei geni coinvolti nello sviluppo stomatale tramite punteggio del fenotipo epidermico
Summary
Questo articolo descrive due metodi di fenotipizzazione senza l’uso di peeling epidermici per caratterizzare i geni che controllano lo sviluppo stomatico. Il primo metodo dimostra come analizzare un fenotipo stomatico utilizzando un’epidermide vegetale colorata con O-colorata con toluidina blu. Il secondo metodo descrive come identificare i ligandi stomatici e monitorare le loro attività biologiche.
Abstract
Gli stomi sono piccoli pori sulla superficie delle piante terrestri che sono coinvolti nello scambio di gas e nel rilascio di vapore acqueo e la loro funzione è fondamentale per la produttività e la sopravvivenza delle piante. Come tale, comprendere i meccanismi con cui gli stomi si sviluppano e modellano ha un enorme valore agronomico. Questo articolo descrive due metodi fenotipici che utilizzano Arabidopsis cotiledoni che possono essere utilizzati per caratterizzare i geni che controllano lo sviluppo e il pattern stomatico. Le prime sono le procedure per l’analisi dei fenotipi stomatici utilizzando cotiledoni blu O-colorati con toluidina. Questo metodo è veloce e affidabile e non richiede l’uso di peeling epidermici, che sono ampiamente utilizzati per le analisi fenotipiche ma richiedono una formazione specializzata. A causa della presenza di residui multipli di cisteina, l’identificazione e la generazione di peptidi EPF bioattivi che hanno un ruolo nello sviluppo stomatico sono stati impegnativi. Pertanto, il secondo è presentato è una procedura utilizzata per identificare i ligandi stomatici e monitorare la loro attività biologica mediante saggi biologici. Il vantaggio principale di questo metodo è che produce dati riproducibili in modo relativamente semplice, riducendo la quantità di soluzione peptidica e il tempo necessario per caratterizzare il ruolo dei peptidi nel controllo del pattern e dello sviluppo stomatico. Nel complesso, questi protocolli ben progettati migliorano l’efficienza dello studio dei potenziali regolatori stomatici, compresi i peptidi secretori ricchi di cisteina, che richiedono strutture altamente complesse per la loro attività.
Introduction
Il corretto pattern e differenziazione degli stomi vegetali sono fondamentali per la loro funzione in due processi biologici fondamentali, la fotosintesi e la traspirazione, e sono applicati dalle vie di segnalazione del peptide EPF. In Arabidopsis, tre peptidi ricchi di cisteina secreti, EPF1, EPF2 e STOMAGEN / EPFL9, controllano diversi aspetti dello sviluppo stomatico e sono percepiti dai componenti del recettore della superficie cellulare, tra cui le chinasi del recettore della famiglia ERECTA (ER, ERL1 e ERL2), SERK e TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Questo riconoscimento porta quindi alla downregulation dei fattori di trascrizione che promuovono la differenziazione stomatica mediante un processo MAPK-dipendente11. La scoperta di questi geni stomatici fondamentali è ottenuta principalmente dallo screening fenotipico di mutanti che presentano difetti epidermici. Questo articolo presenta metodi di fenotipizzazione relativamente semplici ed efficienti per visualizzare gli stomi e altre cellule epidermiche, che sono necessari per identificare e caratterizzare i potenziali geni che controllano il pattern e la differenziazione stomatica.
L’osservazione dei dettagli dell’epidermide vegetale è stata tipicamente ottenuta utilizzando peeling epidermici con o senza colorazione con un colorante come il blu di toluidina O (TBO) o la safranina12,13,14. Tuttavia, la sfida principale di questi metodi è che richiedono una formazione specializzata per sbucciare l’epidermide fogliare senza strappare i tessuti e per osservare e analizzare attentamente i dati di pattern evitando le immagini prese da diverse parti della foglia. Anche i trattamenti chimici per eliminare i campioni di tessuto con reagenti come le soluzioni di clearing a base di cloralio idrato sono stati ampiamente utilizzati per una vasta gamma di materiali biologici 8,15; Questi trattamenti generano una grande quantità di informazioni fenotipiche fornendo immagini di alta qualità, ma richiedono anche l’uso di sostanze chimiche pericolose (ad esempio, formaldeide, idrato di cloralio). Questo documento presenta innanzitutto un metodo di fenotipizzazione relativamente facile e conveniente che produce immagini sufficienti per l’analisi quantitativa, ma non richiede l’uso di sostanze chimiche pericolose e bucce fogliari epidermiche per la preparazione del campione. Un’epidermide cotiledonica colorata con TBO è ideale anche per lo studio dello sviluppo stomatico perché la mancanza di tricomi e il minore gradiente di sviluppo nei cotiledoni consentono l’interpretazione semplice e trattabile dei fenotipi epidermici.
I peptidi EPF stomatici appartengono al gruppo di peptidi ricchi di cisteina specifici per le piante che hanno dimensioni mature relativamente grandi e legami disolfuro intramolecolari tra residui di cisteina conservati. Il corretto ripiegamento conformazionale è fondamentale per la loro funzione biologica, ma i peptidi ricchi di cisteina, che sono prodotti dalla sintesi chimica o da un sistema di ricombinazione eterologo, possono essere inattivi e sono una miscela dipeptidi 3,7,16 correttamente piegati e dispiegati. Pertanto, lo screening dei peptidi bioattivi che hanno un ruolo nel controllo dello sviluppo stomatico è stato un compito molto impegnativo. Questo manoscritto descrive inoltre un saggio biologico per una migliore identificazione e caratterizzazione dei peptidi stomatici bioattivi. In questo metodo, le piantine di Arabidopsis vengono coltivate in una piastra multi-pozzetto contenente mezzi con e senza potenziali peptidi per 6-7 giorni. Quindi, l’epidermide cotiledone viene visualizzata utilizzando un microscopio confocale. In generale, per visualizzare chiaramente l’attività biologica di potenziali peptidi nello sviluppo stomatico, vengono utilizzati i genotipi che producono più e/o meno cellule della linea stomatica, come il mutante epf2, che produce più cellule epidermiche, e la linea STOMAGEN-ami, che conferisce una ridotta densità delle cellule epidermiche 2,4,5, in aggiunta al controllo wild-type Arabidopsis (Col-0) per i saggi biologici.
Nel complesso, i due protocolli qui presentati possono essere utilizzati per la valutazione rapida ed efficiente di vari fenotipi epidermici e per lo screening di piccoli peptidi e ormoni che hanno un ruolo nel controllo del pattern e dello sviluppo stomatico.
Protocol
Representative Results
Discussion
I due metodi di analisi fenotipica per identificare e caratterizzare i geni che controllano il pattern stomatico e la differenziazione qui presentati sono saggi convenienti e affidabili poiché i protocolli non richiedono l’uso di peeling epidermici e attrezzature specializzate (che richiedono tempo e richiedono una formazione speciale per la preparazione del campione) ma producono immagini di alta qualità per l’analisi quantitativa dei fenotipi epidermici.
Una limitazione di questa tecnica p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata finanziata attraverso il programma Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery e la Concordia University. K.B. è supportato dalla borsa di studio nazionale d’oltremare dall’India.
Materials
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
References
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