表皮表現型スコアリング による 気孔発生に関与する遺伝子の同定
Summary
この論文では、気孔の発達を制御する遺伝子を特徴付けるために、表皮剥離を使用しない2つの表現型法について説明します。最初の方法は、トルイジンブルーO染色植物表皮を使用して気孔表現型を分析する方法を示しています。2番目の方法は、気孔リガンドを同定し、それらの生物学的活性を監視する方法を説明する。
Abstract
気孔は、陸上植物の表面にあるガス交換と水蒸気放出に関与する小さな細孔であり、その機能は植物の生産性と生存に不可欠です。このように、気孔が発達し、パターン化するメカニズムを理解することは、途方もない農学的価値があります。この論文では、気孔の発達とパターン形成を制御する遺伝子を特徴付けるために使用できる シロイヌナズナ子 葉を使用した2つの表現型法について説明します。最初に提示されるのは、トルイジンブルーO染色子葉を使用して気孔表現型を分析するための手順です。この方法は高速で信頼性が高く、表現型分析に広く使用されているが専門的なトレーニングを必要とする表皮剥離を使用する必要はありません。複数のシステイン残基が存在するため、気孔の発生に関与する生理活性EPFペプチドの同定と生成は困難でした。したがって、第2に提示されるのは、気孔リガンドを同定し、バイオアッセイによってそれらの生物学的活性をモニターするために使用される手順である。この方法の主な利点は、ペプチド溶液の量と気孔のパターン形成と発生の制御におけるペプチドの役割を特徴付けるのに必要な時間を削減しながら、比較的簡単に再現可能なデータを生成することです。全体として、これらの適切に設計されたプロトコルは、活性に非常に複雑な構造を必要とするシステインリッチ分泌ペプチドを含む潜在的な気孔調節因子の研究の効率を高めます。
Introduction
植物気孔の適切なパターン形成と分化は、光合成と蒸散という2つの基本的な生物学的プロセスにおけるそれらの機能にとって重要であり、EPFペプチドシグナル伝達経路によって実施されます。シロイヌナズナでは、3つの分泌されたシステインリッチペプチド、EPF1、EPF2、およびSTOMAGEN/EPFL9が気孔発生のさまざまな側面を制御し、ERECTAファミリー受容体キナーゼ(ER、ERL1、およびERL2)、SERK、およびTMM1、2、3、4、5、6、7、8、9、10を含む細胞表面受容体成分によって知覚されます。.次いで、この認識は、MAPK依存性プロセス11による気孔分化を促進する転写因子のダウンレギュレーションをもたらす。これらのコア気孔遺伝子の発見は、主に表皮欠損を示す変異体の表現型スクリーニングによって達成される。この論文は、気孔のパターン形成と分化を制御する潜在的な遺伝子を特定および特徴付けるために必要な気孔および他の表皮細胞を視覚化するための比較的簡単で効率的な表現型決定法を提示します。
植物表皮の詳細の観察は、典型的には、トルイジンブルーO(TBO)またはサフラニン12、13、14などの染料で染色するまたは伴わない表皮皮を使用することによって達成された。しかし、これらの方法の主な課題は、組織を引き裂かずに葉の表皮を剥がし、葉のさまざまな部分から撮影された画像を避けながらパターンデータを注意深く観察および分析するための専門的なトレーニングが必要であることです。抱水クロラールベースの透明化溶液などの試薬で組織サンプルを透明化する化学処理も、さまざまな範囲の生物学的材料に広く使用されています8,15;これらの処理は、高品質の画像を提供することにより、多くの表現型情報を生成しますが、危険な化学物質(ホルムアルデヒド、抱水クロラールなど)の使用も必要です。本稿ではまず、定量分析に十分な画像を生成するが、サンプル調製に危険な化学物質や表皮の葉の皮を使用する必要がない、比較的簡単で便利な表現型法を紹介します。TBO染色された子葉の表皮は、毛状突起の欠如と子葉の発達勾配が小さいため、表皮表現型の単純で扱いやすい解釈を可能にするため、気孔の発達の研究にも理想的です。
気孔EPFペプチドは、比較的大きな成熟サイズおよび保存されたシステイン残基間の分子内ジスルフィド結合を有する植物特異的なシステインリッチペプチドのグループに属する。正しい立体配座折り畳みはそれらの生物学的機能にとって重要であるが、化学合成または異種組換えシステムのいずれかによって産生されるシステインリッチペプチドは不活性であり得、適切に折り畳まれたペプチドと折り畳まれていないペプチドの両方の混合物である3、7、16。このように、気孔の発達を制御する役割を持つ生理活性ペプチドのスクリーニングは非常に困難な課題でした。この原稿はさらに、生理活性気孔ペプチドのより良い同定と特性評価のためのバイオアッセイについて説明しています。この方法では、シロイヌナズナの苗木を、潜在的なペプチドの有無にかかわらず培地を含むマルチウェルプレートで6〜7日間増殖させる。次に、共焦点顕微鏡を用いて子葉の表皮を可視化する。一般に、気孔発生における潜在的なペプチドの生物学的活性を明確に視覚化するために、バイオアッセイには野生型シロイヌナズナ対照(Col-0)に加えて、より多くの表皮細胞を産生するepf2変異体や表皮細胞密度の低下2,4,5を付与するSTOMAGEN-ami系統など、気孔系統細胞を多量またはまたは少なく産生する遺伝子型が使用されます。
全体として、ここに提示された2つのプロトコルは、さまざまな表皮表現型の迅速かつ効率的な評価、および気孔のパターン形成と発生を制御する役割を持つ小さなペプチドとホルモンのスクリーニングに使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで紹介する気孔のパターニングと分化を制御する遺伝子を同定および特性評価するための2つの表現型分析方法は、プロトコルが表皮剥離や特殊な機器(時間がかかり、サンプル調製のための特別なトレーニングが必要)の使用を必要としないため、便利で信頼性の高いアッセイですが、表皮表現型の定量分析のための高品質の画像を生成します。
TBO染色された シロ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、カナダ天然資源工学研究評議会(NSERC)のディスカバリープログラムとコンコルディア大学を通じて資金提供されました。KBは、インドからの国立海外奨学金によってサポートされています。
Materials
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
References
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